2003 Fiscal Year Annual Research Report
メダカ可溶性型グアニル酸シクラーゼ遺伝子の転写調節機構及び機能解析
Project/Area Number |
01J10976
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Research Institution | Hokkaido University |
Principal Investigator |
山本 雄広 北海道大学, 大学院・理学研究科, 特別研究員(DC1)
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Keywords | NO / cGMP / メダカ / グアニル酸シクラーゼ / cGMP依存性プロテインキナーゼ / 初期発生 / マイクロインジェクション / in situ hybridization |
Research Abstract |
今年度は、NO/cGMP情報伝達系の初期発生における機能解析を個体レベルで行なうため、アンチセンスオリゴヌクレオチドのメダカ胚への導入による可溶性型グアニル酸シクラーゼ(sGC)および、その主たる下流因子、cGMP依存型プロテインキナーゼ(PKG I)の機能阻害実験を行なった。両者の結果はほぼ同じであり、アンチセンスオリゴ導入胚では後期原腸胚より胚体の左右で死細胞が認められた。また、体節形成の乱れ、中枢神経系、特に眼の形成不全(癒合眼)や耳胞の肥大を引き起こし、本情報伝達系の初期発生における重要性を示した。特に、sGCα_2アンチセンスオリゴ導入胚では尾芽において細胞死が認められた。これは申請者が昨年度明らかにした、初期発生過程におけるnNOS(NO合成酵素)mRNAの発現パターンと一致している。さらに、β_1アンチセンスオリゴ導入胚では著しい発生遅滞が引き起こされる事が明らかになった。このようにβ_1アンチセンスオリゴ導入胚が他の場合に比べ、より重篤な表現型を引き起こすことは、β_1サブユニットがα_1、α_2両サブユニットとダイマーを形成しうるため、α_1/β_1およびα_2/β_1両型の活性型酵素の機能を阻害することによると考えられる。逆に、PKG Iの過剰発現胚では前脳領域が肥大し、小眼となる個体が観察された。この結果は、すでに報告されているcAMP依存型プロテインキナーゼ(PKA)の機能阻害および過剰発現実験とはまったく逆の表現型を示した。また、初期発生におけるPKGの基質候補の一つであった、転写因子Gliがin vivoにおいてもNO/cGMP情報伝達系でリン酸化されることを哺乳類培養細胞を用いた実験で明らかにした。GliはPKAによって活性調節を受けることがすでに報告されており、このような結果はGliを通じたcAMPシグナルとcGMPシグナルのクロストークが初期発生においては重要であることを示唆している(投稿準備中)。さらに、sGCα_2サブユニットの機能解析を行なうにあたり、メダカBACライブラリーよりメダカsGCα_2サブユニット遺伝子を単離(全長約42kbp)し、その遺伝子構造、発現組織、転写開始点等を明らかにした(Zoological Science誌2003年20巻10号1293-1304頁)。また、その転写調節領域の解析も行い、そのプロモーター中にサイレンサー領域を見出し、この領域がsGCα_2サブユニットの転写活性に重要であることを明らかにした(投稿準備中)。
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Research Products
(2 results)
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[Publications] Y.Yao et al.: "Genomic structure and expression of soluble guanylyl cyclase α2 subunit gene in the medaka fish Oryzias latipes."Zoological Science. 20巻10号. 1293-1304 (2003)
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[Publications] S.Fujie et al.: "Nitric oxide synthase and soluble guanylyl cyclase underlying the modulation of electrical oscillations in a central olfactory organ."Journal of Neurobiology. (印刷中). (2004)