2003 Fiscal Year Annual Research Report
哺乳類DNAシトシンメチル基転移酵素の活性制御機構に関する研究
Project/Area Number |
01J11241
|
Research Institution | Kyoto University |
Principal Investigator |
斉藤 基輝 京都大学, 生命科学研究科, 特別研究員(PD)
|
Keywords | メチル化DNA / DNAシトシンメチル基転移酵素 / テロメア / クロマチンリモデリング / アフリカツメガエル / ヘテロクロマチン |
Research Abstract |
高等真核細胞では、DNAシトシンメチル化はヘテロクロマチン領域に多く見られる。しかし、ゲノムのメチル化パターン形成機構は未だ明らかにされていない。クロマチンの構造変化や、ヘテロクロマチン形成時におけるメチル化パターン形成の過程を明らかにするためには、経時変化の観察や関与する蛋白質の機能分析に適した生化学的解析が有用である。そこで私は、アフリカツメガエル卵抽出液を用いたテロメアクロマチンの再構成を試みた。テロメアヘテロクロマチンの形成には、テロメア繰り返し配列DNAと、その配列に特異的に結合するTRF1およびTRF2蛋白質が特に重要であると考えられている。 アフリカツメガエル卵抽出液中において、テロメア繰り返し配列を末端に持つ線状DNAは、線状のまま安定に維持されることが、既に報告されている。しかし、その末端保護作用は、極めて微量のDNAに対してのみ有効であると考えられていた。今回、卵抽出液において、細胞周期進行の時期に着目して、末端保護作用に関して再考を行った。その結果、一部のDNAについては末端の融合が観察されるが、末端を保護する生理活性は、高濃度のDNA存在下においても有効であることが分かった。この観察から、卵抽出液中にテロメア配列を末端に持つ低分子量DNAを多量に混合し、形成されるテロメアDNA蛋白質複合体の構造解析が可能であると予想した。そこで、一方の末端がテロメア配列である線状プラスミドの、他方の末端をビオチン化し卵抽出液と混合した。再構成されたテロメアDNA蛋白質複合体は、ストレプトアビジンを固相化したビーズにより単離した。回収された蛋白質に関して、質量分析計を用いて同定を試みたところ、これまでにテロメアへの局在が知られていなかったDNA修復因子や転写因子が検出された。現在、これらの因子について、機能解析を行っている。
|