1992 Fiscal Year Annual Research Report
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02454177
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| Research Institution | Shinshu University |
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Principal Investigator |
寺脇 良郎 信州大学, 医学部, 教授 (10014333)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
田渕 晃 信州大学, 医学部, 助手 (50236725)
林 哲也 信州大学, 医学部, 助手 (10173014)
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| Keywords | プラスミドRts1 / 複製開始蛋白質 / ori活性化 / ハイブリッド蛋白質 / 機能的ドメイン |
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| Research Abstract |
プラスミドRts1の複製開始蛋白質RepA(構成アミノ酸残基〓288)は複製開始領域oriに結合してRts1-DNAの複製を開始させるポジティブな働きと、開始反応を制御するネガティブな働きとを併せ持つ興味ある蛋白質である。後者の機能には、RepAをコードする遺伝子repAのプロモーター部位に結合して転写頻度を抑制するオートリプレッサー能のほかに、おそらくRepA-DNA複合体がRepAの二量体を介して複雑な三次元構造を形成することが関与していると推定される。このような機能がRepA分子上にどのように局在しているかを知ることを目的として研究を展開した。
成果
1.PepAのori活性化能:RepAのC末端側143AAを欠失させたRepAΔC143にori(Rts1)活性化能が残存していること、RepAΔC143にP1ファージの複製開始蛋白質RepAのC末端側174AAを融合させたRepA(Rts1:P1)-1は、RepAΔ143よりも効率良くori(Rts1)を活性化することを前年度報告した。今年度は更に多くのハイブリッドRepAの作成を試み、Rts1-RepAのN末端側114AAとP1-RepA C末端側174AAを融合させたRepA(Rts1:P1)-2にはori(Rts1)活性化能がないことを確認した。
2.ハイブリッドRepAのin Vivo合成:上記ハイブリッドRepAが宿主大腸菌中で実際に合成されていることを、抗Rts1-RepA抗体を使ったウェスタンブロット法により確認した。現在種々の変異RepA蛋白質のin Vivo安定性を調べている。
3.RepAのオートリプレッサー活性:従来のgoek発現系を用いてRepA(野性型および変異型)のオートリプレッサー能を調べて来たが、現在新たにβ-gal構造遺伝子上流にRts1-repAのプロモーターを挿入した系による検証を開始した。
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