細胞性粘菌の発生分化におけるDNAトポイソメラ-ゼIIの役割

1991 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 02640518
• Research Institution: University of Tsukuba
• Principal Investigator: 田仲 可昌 筑波大学, 生物科学系, 教授 (80091908)
• Keywords: 細胞性粘菌 / DNAトポイソメラ-ゼII / 発生分化 / クロ-ニング / 融合タンパク質

Research Abstract

1。細胞性粘菌Dictyostelium discoideumのDNAトポイソメラ-ゼII(topoII)の遺伝子の構成やDNA配列、その発現様式、さらには発生分化における役割を調べるために、昨年度に引き続いて残りの部分をクロ-ン化することによって全体で6.3Kbにわたってクロ-ン化しこの遺伝子(3,849NT長、1,282アミノ酸、分子量146KDa)の全て含む5Kbにわたって配列を決定した。他の生物と比較すると、細胞性粘菌のこの酵素はN末端領域が50アミノ酸程長く、また他の生物には見られない30アミノ酸程の配列が挿入されていた。mRNAを用いてRTーPCR法で調べたところ、この挿入部分はイントロンでないことが分かった。増殖期の細胞を用いて、ノ-ザンブロットを行なって調べたところ、約4.1kbのmRNAのバンドを一本検出することが出来たが、全RNAを用いた場合は検出出来ず、oligoーdTカラムで調製したpoly(A)RNAを用いてようやく検出出来たので、発現量は少ないものと考えられる。
2。タンパク質レベルでのこの酵素の発現様式や細胞内分布を調べるために、この酵素の抗体を作ることにした。昨年の結果から、酵素分子そのものの精製は困難であることが分かっているので、発現ベクタ-を用いて、大腸菌に酵素分子の一部を作らせ、精製後抗原とし抗体作製に用いることにした。発現ベクタ-pGEXにtopoII遺伝子の一部1.8Kbを組み込み、グルタチオンーsートランスフェラ-ゼとの融合タンパク質として大腸菌内で作らせた。結果は、この融合タンパク質は大腸菌の中でinclusion bodyにつめこまれて、不溶化した状態で存在したので、まずinclusion bodyを精製したのち、融合タンパク質を得てウサギに数回靜注し、現在抗体が出来るの待っているところである。