1990 Fiscal Year Annual Research Report
顕微分光法と酵素免疫組織染色法との共用による高感度・高選択性分析法の開発
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02650535
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| Research Institution | The University of Tokyo |
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Principal Investigator |
戸田 昭三 東京大学, 農学部, 教授 (40011845)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
吉村 悦郎 東京大学, 農学部, 助手 (10130303)
大久保 明 東京大学, 農学部, 助手 (20111479)
山崎 素直 東京大学, 農学部, 助教授 (00011982)
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| Keywords | 顕微分光法 / 酵素免疫組織染色法 / FITC |
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| Research Abstract |
1.植物細胞質酵素ウレア-ゼの抗体作成
新鮮大豆種子により各種クロマトグラフィ-によりウレア-ゼを精製し、電気泳動的に単一な標品を得た。これをBALB/cマウス2週間毎に3回免疫し、常法によりミエロ-マ融合細胞を作成、ELISAにより抗体価を検定しながら高抗体価株を選択し、精製抗体を得た。2種のモノクロ-ナル抗体はともにサブクラスがIgG2aであった。大豆以外にナタマメ、バクテリアのウレア-ゼとの交叉性があることが分かった。
2.抗原の固定法の検討
ウレア-ゼは細胞質に可溶化しており、確立した固定法がない。今回は最も良く用いられるPFA(paraformaldehyde)法、PLP(periodateーlysineーparaformaldehyde)法について検討を加え、一応固定できることを確認した。さらに良好な固定法を検討中である。
3.組織染色
大豆子葉切片に、1.で得られた抗体を結合させ、これに2次抗体を結合させた。2次抗体には抗マウスーIgーFITCで蛍光標識したもの、または抗マウスーIgービオチンにアルカリホスファタ-ゼ標識ストレプトアビジン結合の酵素標識法による発色法を行った。FITC標識試料は蛍光顕微鏡写真で蛍光が導入されたことを確認したが、バックグランドの自然蛍光との判別が必ずしも明瞭ではなかった。
4.顕微分光測定
FITC標識試料について顕微分光測定を行った。測定装置として、フ-リエ変換顕微鏡に高圧HGランプで光源強度を上げ、イメ-ジインテンシファイア付きフォトダイオ-ドアレイ検出器により高感度測定を行った。励起光はフィルタ-カットしたが植物試料中ではリボフラビン等の自然蛍光体が多く、完全な消去はできなかった。FITCに代わる標識蛍光剤の開発を検討中である。
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