2002 Fiscal Year Annual Research Report
膜結合型グルコース脱水素酵素の分子内電子移動の解明とグルコースセンサーへの利用
Project/Area Number |
02F00216
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Research Institution | Yamaguchi University |
Principal Investigator |
山田 守 山口大学, 農学部, 教授
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Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
ELIAS MD. 山口大学, 農学部, 外国人特別研究員
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Keywords | グルコース脱水素酵素 / ピロロキノリンキノン / キノプロテイン / セミキノンラジカル |
Research Abstract |
大腸菌の膜結合型グルコース脱水素酵素(mGDH))はピロロキノリンキノン(PQQ)を補酵素とするキノプロテインの1つであり、呼吸鎖と連結してペリプラズムにおいてグルコースをグルコン酸へと酸化する。mGDHはN末側の疎水領域によって膜と結合し、C末側にPQQやMg2+を含む触媒部位とユビキノン(UQ)との結合部位をもつ。本酵素は単一酵素であることから呼吸鎖初発酵素の最適なモデル酵素と思われる。本研究では、mGDHの分子内電子移動を解析するとともにその知見をグルコースセンサー開発へ利用することを目的としている。 mGDHの分子内電子移動を明らかにするために、セミキノンラジカルの有無を電子常磁性共鳴(EPR)解析によって行った。mGDHを精製して濃縮し、PQQとMg2+を加えてホロ化した。これを用いてEPR解析を行ったところ、基質グルコースを加えるとEPRシグナルが増大した。そのシグナルの位置からセミキノンラジカルであることが示唆された。また、そのシグナルは人工の電子受容体フェリシアニドを加えると消失したことから、1電子伝達因子の存在が示唆され、ユビキノールオキシダーゼにも存在する結合型キノンの可能性が考えられた。そこで、結合型キノンの有無を検討するために、精製mGDHをエタノール抽出して抽出物をHPLCによって解析した。その結果、主なピークはオーセンティックなUQ7と一致し、もう一つの低いピークはUQ8と一致した。以上の結果から、グルコースの酸化にともなってグルコースからの電子はPQQを介して結合型UQへ渡され、続いて膜内のフリーのUQへ渡されていると推測された。現在、UQの合成できないubiA変異株からmGDHを精製し、野生株からのmGDHと比較することによって結合型キノンの存在を立証しようとしている。また、両酵素のキネチック解析を行い、比較しようとしている。 PQQを補酵素とするキノプロテインの構造比較を行い、機能部位の進化的な考察を行った。キノプロテインはmGDHのように単一蛋白のものや複数のサブユニットからなる複合体が存在し、さらに膜結合性と可溶性のものとがある。それらのキノプロテインの構造を比較したところ、PQQ結合ドメインは高い相同性を示し、同様な構造をもつと予測された。また、その基本構造に、膜結合ドメインやヘムC結合ドメインが付加され、さらには異なるサブユニットが結合して呼吸鎖へと繋がったと予想された。これらのドメイン予測に基づいて、今後、グルコース脱水素酵素活性を有する可溶性酵素を遺伝子工学的に作製する。そしてさらに基質特異性を高めて高性能なグルコースセンサーを開発しようと計画している。
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Research Products
(2 results)
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[Publications] MD.Elias, M.Yamada: "Membrane-bound glucose dehydrogenase in E. coli : Molecular aspects in structure, electron transter, and evolution of PQQ-containing quinoprotein dehydrogenases"Recent Developments in Biochemistry. (in press).
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[Publications] M.Yamada, MD.Elias et al.: "Escherichia coli PQQ-containing quinoprotein glucose denydrogenase : Its structure comparison with other quinoproteins"Biochim. Biophys. Acta.. (in press).