2002 Fiscal Year Annual Research Report
Project/Area Number |
02F00664
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Research Institution | Osaka University |
Principal Investigator |
四方 哲也 大阪大学, 大学院・情報科学研究科, 助教授
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Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
WANG JIE 大阪大学, 大学院・情報科学研究科, 外国人特別研究員
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Keywords | Qbeta Replicase / A2(溶菌・吸着酵素) / A2欠損ファージ / 相補性テスト |
Research Abstract |
Qbeta ReplicaseはRNAファージ由来の複製遺伝子である。QbetaファージのゲノムRN上にA2(溶菌・吸着酵素)、Coat(外殻タンパク質)、RT(感染に必要なタンパク質)、β(RNAレプリカーゼのサブニット)の四つの遺伝子をもつ。RNAレプリカーゼのサブニットは大腸由来因子と複合体を形成し、RNA依存型RNA複製酵素となる。また、Qbeta Replicaseは自己認識して複製する鋳型特異性をもつ。そこで遺伝子発現系を必要最小限に単純化するためにQbetaファージRNAからA2、Coat遺伝子を欠損させ、βサブニット遺伝子だけをもつ自己複製システムを構築した。 1.pACYCQβ1×A_2+pBADA_2及びpACYC 1×A2プラスミドを作製し、BL21に形質転換した。酵素切断により確認。欠損されたA2遺伝子は欠損ファージを作製するのをタイター測定法で実験した。A2を供給するプラスミドとしてpBADA2を使った。結果、BL21(pACYCQβ1×A_2/pBADA_2)からえられたファージはA/λを指示菌としたとき、BE110より優位さが見られた。また、wideファージに見られない位置にアンパ・ストップコドン存在することを示すNhe Iサイトが確認されたことから、A2欠損ファージであることが示唆された。 2.Amberファージを用いたcomplemente成功するかどうかはA 2 Amberファージをp BADA2を持った大腸菌BE110(感染させる大腸菌の条件、F^+、Sup^-)における相補性テストを行なう。結果、A2の溶菌性における相補実験において、A2の溶菌性を持ったなくでも、A2を持ったないBE110より、10^5ぐらいの増幅がみられた。また、A2を溶菌しない場合には、arabinoseの誘導にもかかわらず、A/λとBE110の差がかけたAmber phageより縮小している。このことから、増幅と見られたphageはwild phageであると思われる。A2を溶菌した場合はA2を溶菌しない場合と比べプラークの数が2倍の差しかないですが、arabinoseの誘導するとarabinoseの誘導しないより4倍ぐらい増幅し、さらにA/λとBE110の差がかけたAmber phageより大きく開いた。それはAmber phageであることが示唆される。この実験では、A2の機能と溶菌性の関係は又ははっきり分かっていませんが、言えることはA2が溶菌性を持ってば、Amber phageを作る環境しやすくなると思われる。 今後の予定 A2をdeletionして、最小限の複製単位を獲得する。
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