2002 Fiscal Year Annual Research Report
Project/Area Number |
02F00813
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Research Institution | Kyoto Prefectural University of Medicine |
Principal Investigator |
木下 茂 京都府立医科大学, 医学部, 教授
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Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
CHE John Connon 京都府立医科大学, 医学部, 特別研究員
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Keywords | クロライドチャネル / 角膜 / CLCA2 / 細胞増殖 |
Research Abstract |
GenBankに登録のあるヒト、ウシ、マウスCLCA2遺伝子およびCLCA遺伝子ファミリーであるヒトCLCA1,CLCA3,CLCA4のアミノ酸配列についてマルチプルアラインメントを行い、ヒトCLCA2遺伝子で特異的な配列を検討した。さらに抗原性、ペプチド合成効率を考慮した上で2つのペプチド配列(CLCA2_1,CLCA2_2)を抗体作成用の抗原ペプチドとして合成した。これをアジュバンド(KLH)と架橋し、ウサギに免疫した。免疫前、免疫後24日目と35日目の血清について抗原ペプチドでタイターチェックを行ったところ、両者ともに抗体価の上昇が確認できた。さらにヒトCLCA2のコーディング領域を哺乳類タンパク発現用ベクターにクローニングし、配列をシーケンサーにて確認した後、Hela細胞で強制発現させ、これに対して免疫染色を行ったところ、CLCA2_1に対する抗体では明らかな陽性染色は認められなかったが、CLCA2_2に対する抗体で免疫前血清との間に明瞭な染色差が見られた。この染色像はベクター内在のV5エピトープに対する抗体での染色像と完全に致し、Hela細胞で強制発現させたヒトCLCA2タンパクに対して反応していることが明らかとなった。さらにヒト角膜組織に対して免疫染色を行ったところ角膜上皮基底細胞層の基底側細胞膜に染色像が見られた。さらに現在CLCA2_2に対する抗体についてWestern Blottingにて抗体の特異性の検討を行っている。
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