2003 Fiscal Year Annual Research Report
Project/Area Number |
02J00003
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Research Institution | Hokkaido University |
Principal Investigator |
下野 和実 北海道大学, 薬学研究科, 特別研究員(PD)
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Keywords | レチナール蛋白質 / 極大吸収波長 / オプシンシフト / キメラ蛋白質 / バクテリオロドプシン / ファラオニスフォボロドプシン / プロトン化シッフ塩基 |
Research Abstract |
赤外分光法によるシッフ塩基の振動モードの解析 我々は,名古屋工業大学神取教授との共同研究により赤外分光法を用いたppRとBRとの比較解析を2001年度より進めている.本年度は,吸収波長制御の鍵となる発色団のシッフ塩基部分の解析を試みた.リシン側鎖を^<15>Nで標識した試料の赤外差スペクトルを測定し,シッフ塩基由来のバンドを帰属した.ppRのN-D伸縮はBRより低波数側に現れ,強い水素結合環境にあることが明らかとなった.BRと違ってppRではN-D伸縮は水分子のO-D伸縮と異なる振動数領域に現れたが,これは両者のシッフ塩基領域の相違を反映した結果であると考えられ,このような水素結合構造の違いが異なる吸収波長に関与していると考えられる[Shimono et al.(2003)Biochemistry,42,7801-6.]. セミランダム変異導入による吸収波長制御部位の同定 昨年度,我々は,BRとppRの様々なキメラ蛋白質を作製し,それぞれの吸収波長を比較検討した.その結果,ヘリックスDとEの相互作用による効果が吸収波長制御の主要因であることが明らかとなった[Shimono et al.(2003)J.Biol.Chem.,276,23882-9.].そこで本年度は,ヘリックスDとEのアミノ酸残基から吸収波長制御部位を同定するためにセミランダム変異導入法を適応した.1次選別として,450個のクローンの変異蛋白質の発現チェックを行った.このうち長波長シフトしていると思われる呈色を示したクローンから変異蛋白質を精製し,吸収スペクトルを測定した結果,5個のクローンから大きく長波長シフトした変異蛋白質を得た.これらのアミノ酸配列を比較した結果,ヘリックスDの107,108,111の3か所の部位がヘリックス間相互作用に重要であることが示唆された.またヘリックスEの解析から,N末端側領域(124-132)の重要性が示唆された.現在,検体数を増やした解析と共に,長波長シフトした変異体を鋳型としてランダム変異体を作製することを試みている.
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Research Products
(6 results)
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[Publications] Kazumi SHIMONO et al.: "Importance of the Broad Regional Interaction for Spectral Tuning in Natronobacterium pharaonis Phoborhodopsin (Sensory Rhodopsin II)"Journal of Biological Chemistry. 278(26). 23882-23889 (2003)
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[Publications] Kazumi SHIMONO et al.: "Vibrational Modes of the Protonated Schiff Base in pharaonis Phoborhodopsin"Biochemistry. 42(25). 7801-7806 (2003)
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[Publications] Yuki SUDO et al.: "Hydrogen bonding alteration of Thr204 in the complex between pharaonis phoborhodopsin and its transducer protein"Biochemistry. 42(48). 14166-14172 (2003)
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[Publications] Yuki SUDO et al.: "Interaction of Natronobacterium pharaonis phoborhodopsin (sensory rhodopsin II) with its cognate transducer probed by increase in the thermal stability"Photochemistry and Photobiology. 78(5). 511-516 (2003)
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[Publications] Tadashi ARAKAWA et al.: "Dynamic structure of pharaonis phoborhodopsin (sensory rhodopsin II) and complex with a cognate truncated transducer as revealed by site-directed 13C solid-state NMR"FEBS Letters. 536(1-3). 237-240 (2003)
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[Publications] Maki SATO et al.: "Role of Ser130 and Thr126 in the chloride binding and photocycle of pharaonis halorhodopsin"Journal of Biochemistry. 134(1). 151-158 (2003)