2003 Fiscal Year Annual Research Report
酸化的DNA損傷を認識する新規な修復酵素の精製とキャラクタリゼーション
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02J00638
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Research Institution | Osaka Prefecture University |
Principal Investigator |
正岡 綾 大阪府立大学, 農学生命科学研究科, 特別研究員(PD)
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Keywords | 活性酸素 / DNA損傷 / 5-ホルミルウラシル / 5-ヒドロキシウラシル / SMUG1 / 酵素精製 / 部位特異的アミノ酸置換 / 塩基除去修復機構 |
Research Abstract |
5-ホルミルウラシル(fU)は電離放射線や活性酸素によりチミンから生成する主要な酸化損傷である。同損傷は電子吸引性のホルミル基の影響でイオン化が起こりDNA複製の際、本来の対合塩基だけでなく誤ったグアニンとも対合するため、突然変異性を示す。これまでに、fU修復活性を持つ酵素として大腸菌ではAlkAを同定した。真核生物におけるfU修復酵素は昨年度の研究で、SMUG1であることを明らかにした。 本年度はSMUG1抗体による中和実験で残留活性が認められた5-ヒドロキシウラシル(hoU)の修復活性の精製を試みた。HoUを部位特異的に含むオリゴヌクレオチド基質を^<32>P標識し、二本鎖とした後、HeLa細胞祖抽出物をインキュベートした。反応生成物はポリアクリルアミド電気泳動により分析した。HoU特異的な活性が存在すると基質オリゴヌクレオチドの切断パンドが得られるので、これを酵素精製の指標とした。現在、カラムクロマトグラフィーにより活性を精製しているが、同定には至っていない。今後も引き続き同様の検討を行い、MSによる酵素の同定を行う。 SMUG1については、その酵素反応機構を明らかにする目的で、アミノ酸を特異的に置換した変異体タンパクを作製し、酵素活性の変化を検討した。SMUG1の部位特異的アミノ酸置換を考える上でUDGをモデルとした。目的のアミノ酸置換が起こるように設定した変異導入用プライマーとその相補プライマーを用い、ポリメラーゼ反応によりSMUG1変異体発現用プラスミドを構築した。変異体タンパク質は大腸菌で発現させ、カラムクロマトグラフィーにより精製し、酵素活性は^<32>P標識したオリゴヌクレオチド基質を基質として酵素とインキュベートし、反応生成物をPAGE分析することにより測定した。その結果、損傷塩基の除去反応に関わると考えられるSMUG1の重要なアミノ酸を特定することができた。
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Research Products
(4 results)
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[Publications] Nakano, T.: "DNA-protein cross-link formation mediated by oxanine. A novel genotoxic mechanism of oxide-induced DNA damage"Journal of Biological Chemistry. 273. 25264-25272 (2003)
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[Publications] Matsubara, M.: "Identification and characterization of mammalian 5-formyluracil-DNA glycosylase"Nucleic Acids Research Suppliment. 3. 233-234 (2003)
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[Publications] Masaoka, A.: "Repair roles of hSMUG1 assessed by damage specificity and cellular activity"Nucleic Acids Research Suppliment. 3. 263-264 (2003)
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[Publications] Katafuchi, A.: "Differential specificity of human and Escherichia coil endonuclease III and VIII homologues for oxidative base lesions"Journal of Biological Chemistry. (印刷中). (2004)