ゲノム情報の維持伝達に多面的に機能するクランプとそのローダー系の解析

2002 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 02J03453
• Research Institution: Nara Institute of Science and Technology
• Principal Investigator: 塩見 泰史 奈良先端科学技術大学院大学, バイオサイエンス研究科, 特別研究員(DC2)
• Keywords: 分子生物学 / ゲノム情報 / クランプ / クランプローダー / DNA複製 / チェックポイント / 染色体分配

Research Abstract

DNA複製で機能するクランプとクランプローダー、PCNAとRFCを研究対象としてこれまでに確立した解析法を用い、新たにDNA障害および複製停止チェックポイント応答のクランプ・クランプローダーと考えられるRad9-Hus1-Rad1(Rad9-1-1)とRad17-RFC、また、娘染色体間接着および分配機構のクランプローダーと考えられるChl12-RFC、それぞれの複合体の再構築と、これらが有する特異的な機能と分子構造を明らかにすることを目的とした。
Rad9-1-1とRad17-RFCそれそれをバキュロウイルス発現系を用いて再構築し、精製複合体を得た。Rad17-RFCはRFCと同様に、プライマー/鋳型DNAとの結合およびATPase活性を示し、クランプローダーとしての基本的特性を有していることが明らかとなった。また、Rad17-RFCはRad9-1-1との特異的な結合を示し、これらがクランプ・クランプローダーの対として機能すると考えられた。さらに、電子顕微鏡による構造解析ではRad9-1-1、Rad17-RFCはPCNA、RFCと区別できない分子構造をしていることを明らかにした。以上の結果から、Rad9-1-1とRad17-RFCはチェックポイントで機能する第二のクランプ・クランプローダー系であることが強く示唆された。
一方、Chl12-RFCの対となるクランプは、これまでに明らかにされてはいなかった。しかし、当研究室で行われたPCNA結合因子のプロテオミクス解析の結果から、新規PCNA結合因子としてChl12が発見された。そこで、再構築系から精製したChl12-RFCとPCNAとの結合を解析した結果、これらは特異的に結合することが明かとなった。以上より、Chl12-RFCが染色体接着で機能する第二のPCNAローダーであることが強く示唆された。
以上の研究成果は雑誌論文で発表した。

Research Products

• [Publications] Yasushi Shiomi: "Clamp and clamp loader structures of the human checkpoint protein complexes, Rad9-1-1 and Rad17-RFC"Genes Cells. 7(8). 861-868 (2002)
• [Publications] Satoshi Ohta: "A Proteomics Approach to Identify Proliferating Cell Nuclear Antigen (PCNA)-binding Proteins in Human Cell Lysates. IDENTIFICATION OF THE HUMAN CHL12/RFCs2-5 COMPLEX AS A NOVEL PCNA-BINDING PROTEIN"J Biol Chem.. 277(43). 40362-40367 (2002)