2002 Fiscal Year Annual Research Report
Project/Area Number |
02J05360
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Research Institution | Nagoya University |
Principal Investigator |
山下 泰恒 名古屋大学, 大学院・生命農学研究科, 特別研究員(DC2)
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Keywords | 細胞外マトリックス / ラミニン / ヘパリン |
Research Abstract |
1、サブ領域G4のどのアミノ酸がヘパリン結合活性に影響を与えるか? 申請者は、現在までにラミニンα4鎖G領域のサブ領域G4をGST融合タンパクとして大腸菌に発現させた。発現させたタンパク質は予想どうりヘパリン結合活性を持つことを確認した。さらにG4内のヘパリン結合に関わると考えられる27種類の塩基性アミノ酸を部位突然変異によりアラニンに置換した変異体タンパク質を作製した。これらのタンパク質は、SDS-PAGE電気泳動とα4鎖G領域Polyclonal抗体を用いたWestern blotを行い確認した。現在これらの27種類の変異体タンパク質のヘパリン結合活性への影響を調べている最中である。 2、サブ領域G4〜5の三次元構造の解析 申請者は、現在までにサブ領域G4〜5を哺乳類細胞に発現させるためのプラスミド(pEFneoα4G4-5)を作製し、CHO細胞DHFR遺伝子欠損株にDHFR遺伝子と共発現させG418,MTXにより安定発現株を選別しG4〜5タンパク質を大量に発現、分泌する細胞を確立した。この細胞の培養上清からヘパリンカラム、ゲルろ過カラムにより結晶化に使用できる混合物を含まないG4〜5タンパクを精製した。このタンパク質は、SDS-PAGE電気泳動、α4鎖G領域Polyclonal抗体を用いたWestern blot、N末端アミノ酸シークエンスを行い確認した。また、G4〜5タンパク質を用いて抗G4〜5polyclonal抗体を作製した。現在、Hampton reserch社の結晶化キットを用いたHanging drop法により結晶化を試みている。
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Research Products
(1 results)