2002 Fiscal Year Annual Research Report
転写因子としてのポリADPリボース合成酵素(PARP)の役割の解明
Project/Area Number |
02J10306
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Research Institution | Tohoku University |
Principal Investigator |
秋山 貴子 東北大学, 大学院・医学系研究科, 特別研究員(PD)
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Keywords | ポリADPリボース合成酵素(PARP) / Reg / 転写 / DNA結合ドメイン / リコンビナント蛋白 / Gel Mobility Shift Assay / Southwestern法 / DNA affinity chromatography |
Research Abstract |
申請者は、インスリン産生細胞再生増殖因子であるRegの発現はReg遺伝子の転写誘導によること、またその転写誘導は、ポリADPリボース合成酵素(PARP)が転写因子としてReg遺伝子プロモーター領域のGC box類似配列に特異的に結合し、その他複数の因子をリクルートし転写複合体を形成することで引き起こされることを明らかにした。そこで本研究では(1)PARPが転写因子として機能する際にPARPのどのドメインがReg遺伝子プロモーター領域に特異的に結合するDNA結合ドメインとして機能しているのか、(2)Reg遺伝子上流域に形成されるPARPを含む転写複合体がどのような因子から成るのかを同定し、(3)PARPのこれらの因子との結合ドメインを明らかにすることで、転写因子PARPによる遺伝子発現機構を解明する。 平成14年度の研究は以下のように進行した。 1. PARPがReg遺伝子プロモーター領域と特異的に結合する際に機能しているPARPのDNA結合ドメインを同定するため、以下のように野生型および変異型PARPの発現系を確立し、精製を行った。RT-PCR法により得た野生型PARP cDNAおよびsite-directed mutagenesisにより作製した変異型PARP cDNAをバキュロウイルストランスファーベクターに組み込み、昆虫細胞(Sf9)に導入してhomologous recombinationにより野生型および変異型PARPのリコンビナントバキュロウイルス液を得ることに成功した。得られたリコンビナントウイルス液からPlaque Assayを用いてそれぞれ十数クローンのウイルスを単離し、昆虫細胞に感染させ、PARP蛋白質の発現を確認した。数回のウイルス増幅により感染率の高いウイルス液を得た後、これを昆虫細胞にMOI(multiplicity of infection)=3の条件で感染させPARP蛋白質を発現させた。感染昆虫細胞の細胞抽出液中には大量のPARPを認め、PARP発現系の樹立に成功した。PARP蛋白質の精製は、硫安分画法およびDNA-cellulose chromatographyを用いて行った。 2. PARPを含む転写複合体の構成因子を分離・同定するために使用するDNA-affinity columnの作製に成功した。具体的には、PARPが特異的に結合するReg遺伝子プロモーター領域のGC box類似配列P1、およびこの配列への変異導入によりPARPが結合しない配列M1のオリゴヌクレオチドを合成し、これらをタンデムにつないで得た二本鎖DNAをNHS-activated sepharose columnに結合させた。この結果、P1配列については3.1nmol DNA/ml matrix、M1配列については3.7nmol DNA/ml matrixのDNA-affinity columnの作製に成功した。
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Research Products
(9 results)
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[Publications] Michiaki Unno: "Production and characterization of Reg knockout mice"Diabetes. 51. S478 (2002)
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[Publications] 高沢 伸: "Reg-Reg受容体系によるβ細胞cyclin D1遺伝子の活性化"糖尿病. 45. S169 (2002)
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[Publications] 高沢 伸: "NAD^+,ポリADPリボース,サイクリックADPリボースによる細胞の死・再生・機能発現"生化学. 74. 620 (2002)
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[Publications] Nausheen J. Shervani: "Autoantibodies to a pancreatic beta-cell regeneration factor, REG, in diabetes patients"生化学. 74. 819 (2002)
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[Publications] 野口 直哉: "FK506-Binding Protein 12.6 ノックアウトマウスではブドウ糖刺激によるインスリン分泌が低下していた"生化学. 74. 919 (2002)
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[Publications] Hiroshi Okamoto: "The mechanism of β-cell regeneration by Reg protein : Experiments with Reg knockout mouse islets"Diabetes. 52(In press). (2003)
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[Publications] 野口 直哉: "Cyclic ADP-riboseによる小胞体からのCa^<2+>放出機構:FK506結合蛋白質の関与"Diabetes Frontier. (In press). (2003)
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[Publications] 野口 直哉: "FK506結合蛋白質欠損マウスのグルコース刺激によるインスリン分泌の低下"糖尿病. 46(印刷中). (2003)
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[Publications] 岡本 宏: "膵β細胞の死から再生へ:Reg-Reg受容体情報伝達系による再生医学"糖尿病. 46(印刷中). (2003)