2003 Fiscal Year Annual Research Report
Project/Area Number |
03J02031
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Research Institution | Himeji Institute of Technology |
Principal Investigator |
武内 総子 姫路工業大学, 理学研究科, 特別研究員(DC2)
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Keywords | 神経内分泌小胞 / アスコルビン酸 / EPR / 共鳴ラマン |
Research Abstract |
cytochrome b_<561>は副腎髄質クロマフィン小胞に存在する分子量約28000の膜貫通型電子輸送タンパク質である。b_<561>は細胞質中のアスコルビン酸(AsA)から受け取った電子を小胞内のモノデヒドロアスコルビン酸(MDA)ラジカルに伝達している。本研究では、AsAに由来しb_<561>分子により遂行される神経内分泌小胞に特異的な膜貫通電子伝達反応のより詳細な機構を明らかにするため、種々の物理化学的・生化学的解析方法を用いた総合的な解析を行った。 酸化型b_<561>をdiethylpyrocarbonate(DEPC)により処理することによって、細胞質側のヘムbに配位している2つのHis残基が修飾され、ヘムbの中間点電位が大幅に下がり、その結果、AsAから電子を受け取る能力が選択的に失われることがわかっている。このようなDEPC処理したb_<561>のEPR解析によりg_z=3.69ヘム種がAsAでは還元できない型に変わっていたが、g_z=3.14ヘム種には影響が無いことがわかった。b_<561>の共鳴ラマンスペクトルは酸化型、還元型のいずれにおいても2個のヘムbが6配位low-spin状態であることを示していた。DEPC処理は酸化型、還元型b_<561>の共鳴ラマンスペクトルには影響を与えていなかった。 人工小胞に再構成したb_<561>のトポロジーをMALDI-TOF-MS解析により解析した結果、人工小胞膜中ではクロマフィン小胞での向きとは逆方向に再構成されていることがわかった。再構成したb_<561>を用いて、3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)2,5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide(MTT)活性を見たところ、小胞内のAsAからの電子がb_<561>によりMTTに伝達されることがわかった。同様にcytochrome c, DBHにも電子が伝達されることが確認されている。
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Research Products
(4 results)
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[Publications] Tadakazu, Takigami: "Stopped-flow analyses on the reaction of ascorbate with cytochrome b_<561> purified from bovine chromaffin vesicle membranes"Biochemistry. 42・27. 8110-8118 (2003)
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[Publications] Motonari Tsubaki: "Transmembrane electron transfer in the neuroendcrine vesicles : the ascorbate-cytochrome b_<561> system"Current Topics in Biochemical Research. 4. 39-52 (2003)
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[Publications] Yumiko Seike: "Reversely-oriented cytochrome b_<561> in reconstituted vesicles catalyzes transmembrane electron transfer and supports extravesicular dopamine β-hydroxylase activity"Journal of Biochemistry. 134・6. 859-867 (2003)
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[Publications] Fusako Takeuchi: "Properties of two distinct heme centers of cytochrome b_<561> from bovine chromaffin vesicles : redox titration, EPR, and resonance Raman studies"Journal of Biochemistry. 135・1. 53-64 (2004)