2004 Fiscal Year Annual Research Report
細胞内蛋白質の活動の可視化を目指した蛍光性バイオセンサー構築
Project/Area Number |
03J08766
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Research Institution | Kyoto University |
Principal Investigator |
清中 茂樹 京都大学, 工学研究科, 特別研究員(PD)
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Keywords | 光アフィニティーラベル化 / プロテオミクス / ビオチン / アセチルコリン受容体 / 免疫抑制剤 |
Research Abstract |
昨年度に合成した数種類の光アフィニティーラベル化剤を用いて、今年度はムスカリン性アセチルコリン受容体への光アフィニティーラベル化後修飾法を行った。 in vitroの実験としては、受容体を過剰発現させた細胞(CHO K-1,HEK293)から回収してきた細胞膜画分を用いた。その細胞膜画分に光アフィニティーラベル化剤を加えてUV光を照射することで光ラベル化を行った。続いてビオチン型修飾剤と反応させることで、受容体に選択的なビオチン修飾を施した。ウェスタンブロッティング法によって反応の確認を行い、ムスカリン受容体に光ラベル化及びビオチン化反応が進行していることを確認できた。この手法は今回の結果に限らず、あらゆるリガンド-受容体蛋白質の組み合わせに適用可能であるので、リガンド及び受容体の新しい同定法になりえると考えられた。 そこで、新規の免疫抑制剤としてメクリーニングされた化合物の作用蛋白質を同定するためにこの手法を応用した。その際には、この免疫抑制剤の一部に光反応基及びビオチン修飾基を導入したラベル化剤を設計して有機合成した。作用部位の候補として考えられる蛋白質を過剰発現させた細胞にこのラベル化剤を加えて上記と同様にラベル化反応およびビオチン修飾を行った。ウェスタンブロッティングの結果から、この免疫抑制剤の作用蛋白質の同定に成功した。この結果から、薬物の作用部位を簡便に同定する新しい方法論としての有効性が確認できた。
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Research Products
(4 results)