タンパク質構造から見る植物P450の反応機構と生理機能

2003 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 03J09405
• Research Institution: Nihon University
• Principal Investigator: 澤田 有司 日本大学, 大学院・生物資源科学研究科, 特別研究員(DC2)
• Keywords: 植物 / シトクロムP450 / CYP93ファミリー / 分子進化 / ホモロジーモデリング / イソフラボノイド骨格合成酵素 / 部位特異的変異導入 / 形質転換植物

Research Abstract

植物には,一種あたり数百のP450が存在し,天然化合物(二次代謝産物)生合成で多様な反応を示す.特に,マメ科のイソフラボノイド骨格合成酵素(CYP93C)は,P450反応としては特異なアリール基の1,2-転位反応を伴うヒドロキシル化を触媒する.これまでにマメ科カンゾウのCYP93C2の推定3次構造に基づく変異導入を行い,転位反応の鍵アミノ酸残基(Ser310,Lys375)を同定している.本年度は,新たにLeu371との変異導入を組み合わせた結果,転位反応が減少または喪失し,単純なヒドロキシル化反応と二重結合の導入反応が増加する変異酵素が得られた.この結果から,これらのアミノ酸残基によって反応特異性が規定されていることが明確になった.また,変異酵素に見られた二重結合の導入反応は,非マメ科に広く分布するCYP93Bと同じ酵素活性である.従って,CYP93BとCYP93Cが共通の先祖型遺伝子から分子進化した過程が推定された.さらに,CYP93Cのタンパク質構造の解明を目指し,大腸菌によるタンパク質の大量発現を行い,従来用いていた酵母発現系の約100倍(4mg P450 protein/1L culture)の機能タンパク質が得られた.今後,機能タンパク質を精製し,NMRによる構造解析や結晶化の条件検討を試みる.
機能既知のCYP93は,いずれもフラボノイド生合成酵素であるが,酵母で異種発現させたシロイヌナズナのCYP93D1は,フラボノイドを基質としなかった.CYP93D1の機能を同定するために,T-DNAタグラインのスクリーニングと減圧浸潤法による遺伝子導入によって,CYP93D1の機能喪失株および過剰発現株を得た.今後,これらの成分変化から酵素機能を推定し,表現型の変化から生理機能を同定する.

Research Products

• [Publications] Akashi, T., Sawada, Y., Shimada, N., Sakurai, N., Aoki, T., Ayabe, S.: "cDNA cloning and biochemical characterization of S-adenosyl-L-methionine : 2,7,4'-trihydroxyisoflavanone 4'-O-methyltransferase, a critical enzyme of the legume isoflavonoid phytoalexin pathway."Plant and Cell Physiology. 44. 103-112 (2003)