遺伝子改変動物に由来する細胞株を用いた、プリオンタンパク質の機能に関する研究

2003 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 03J10664
• Research Institution: The University of Tokyo
• Principal Investigator: 林田 直樹 東京大学, 大学院・農学生命科学研究科, 特別研究員(PD)
• Keywords: プリオンタンパク質 / プリオン病 / イヌ型プリオンタンパク質 / RT-PCR / 胚操作 / 胚移植 / トランスジェニックマウス / マウススクレイピー持続感染細胞

Research Abstract

ウシ海綿状脳症(BSE)やクロイツフェルト・ヤコブ病などのプリオン病の原因物質として知られるプリオンタンパク質の機能を解析するため、以下の実験を行なった。
1)スクレイピー感染神経細胞株におけるイヌ型プリオンタンパク質の発現導入(イヌプリオンタンパク質遺伝子の単離と発現ベクターの構築)
イヌ白血球から採取したtotal RNAを用いて、RT-PCRを行なったところ、CaPrP cDNAと思われる推定802bpsのバンドを得た。次に、このCaPrP cDNAをクローニングするため、pBluescriptベクターにこのバンド由来のDNAをランダムに組み込んだ後、大腸菌DH5a株へのトランスフェクトならびにカラーセレクションによって目的の断片を得た。さらにレトロウイルス由来ベクターpSFF(Friend spleen focus-forming virus由来)にサブクローニングし、psi-2繊維芽細胞をパッケージ細胞として、トランスフェクトに用いるプラスミドを増幅している。今後、マウススクレイピー持続感染細胞である視床下部由来神経細胞株ScGT1-trkならびに神経芽腫細胞ScN2a。にこのプラスミドを導入し、CaPrPの構造変化をウエスタンブロット法により検討する。
2)イヌプリオンタンパク質遺伝子トランスジェニック(Tg)マウスの作製(Tgマウス作製のための胚操作ならびに移植系の構築)
CaPrP-Tgマウスの作製に先立ち、胚操作ならびに胚移植系をTCRマウスを用いて確立した。4-6週令のマウスに性腺刺激ホルモンを注射して過排卵を誘導した後交配させ、交配後2.5日の子宮と卵管から8細胞期胚と桑実胚を採取した後、偽妊娠マウスの子宮に移植した。移植胚は、そのまま培養した群以外に、他の胚と凝集させた融合胚群、電気刺激によって四倍体化させた胚と凝集させた融合胚群などを用いたが、いずれにおいても産仔を得ることに成功した。