2004 Fiscal Year Annual Research Report
RNAポリメラーゼIIによる転写伸長反応を制御する因子群の機能解析
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03J50311
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| Research Institution | Tokyo Institute of Technology |
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Principal Investigator |
遠藤 正紀 東京工業大学, 大学院・生命理工学研究科, 特別研究員(DC1)
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| Keywords | 転写伸長因子 / 転写伸長複合体 / 核抽出液 / 部分再構成 / ゲルシフト法 / バキュロウイルス発現系 |
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| Research Abstract |
当研究室では新規転写伸長因子DSIF/NELFを精製・同定し、これらの因子が協調してRNAPIIの伸長反応を抑制することを報告した。さらに転写伸長因子P-TEFbによってリン酸化されたRNAPIIにはDSIF/NELFが結合しないことから、DSIF/NELFによる抑制はP-TEFbによって解除されるというモデルを提唱した。しかし、その後の解析によりP-TEFb単独ではこの伸長抑制を解除しきれないことが示され、DSIF/NELF/P-TEFbによる転写伸長制御にさらなる因子の必要性が示唆された。そこで本研究ではこの新規因子の同定と機能解析を生化学的・分子生物学的手法を用いて行い、DSIF/NELFによる転写伸長制御の全貌を明らかにすることを目的とした。
これまで磁気ビーズ固定化DNAを鋳型とするアッセイ系を試みてきたが、この方法ではヌクレアーゼによる阻害が著しいので再現性を確保することが困難であった。また高度に精製された転写因子を利用するアッセイ系においても固定化DNAの場合と同様の問題が発生したので、最終的にはHeLa細胞核抽出液を部分再構成したフラクションと液相系DNA(非固定化DNA)を用いたアッセイ系を利用することとした。
これと平行して、転写伸長複合体とDSIF/NELFの結合および解離を検討するためのアッセイ系を構築した。この系はゲルシフト法を利用して複合体の状態を検討するもので、新規因子を同定した後の機能解析に利用することを考えている。また、これまではバキュロウイルス発現系を利用して調整した組換えP-TEFbを用いていたが、さらに高純度のものを調整するためにFLAGタグの融合した組換えP-TEFbを発現するHeLa細胞株を樹立した。
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