DNA増幅法に基づく食中毒原因細菌の自動検出法の開発

1992 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 04557024
• Research Institution: Kyoto University
• Principal Investigator: 西渕 光昭 京都大学, 医学部, 助教授 (50189304)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 高野 純 島津製作所, 技術研究本部中央研究所, 主任研究員 ; 倉園 久生 京都大学, 医学部, 助手 (90186487) ; 竹田 美文 京都大学, 医学部, 教授 (30029772)
• Keywords: 食中毒原因細菌 / 腸炎ビブリオ / 病原大腸菌 / 黄色ブドウ球菌 / エンテロトキシン遺伝子 / PCR法 / DNA増幅法

Research Abstract

食中毒原因細菌のDNA増幅法(PCR法)による検出のために本研究で採用したアプローチが適切であることを、まず腸炎ビブリオ菌株について実証した。病原性菌株は、耐熱性溶血毒遺伝子(tdh)に限定できず、tdh類似遺伝子(trh)を持つ可能性があり、しかもtrh遺伝子の塩基配列にバラツキが多いことを確認した。tdh遺伝子とtrh遺伝子検出用のPCRプライマーセットを、それぞれ7組と5組デザインし、増幅条件を比較検討した。最終的に263菌株を対象として、標的遺伝子をもれなく検出できるプライマーセットと増幅条件を得た。すなわち、このPCR法で得られた結果は、ポリヌクレオチドプローブを用いたハイブリダイゼーション法による標的遺伝子の検出結果と完全に一致した。また40種におよぶ他の細菌133菌株は、このPCR法では陰性であり、特異性が確認できた。
同様の方法で、病原大腸菌の耐熱性エンテロトキシンと易熱性エンテロトキシンおよび黄色ブドウ球菌の各種エンテロトキシンの遺伝子検出のためのPCRプライマーと増幅の条件を確立した。
さらにPCR産物の新しい検出法を開発した。この方法では、PCR産物をビオチンで標識して、アフィニィティ法によりマイクロタイタートレーの穴にトラップする。これを非アイソトープ(アルカリフォスファターゼ)標識したオリゴヌクレオチドプローブを用いて検出する。数コピーの標的遺伝子を所用時間45分で検出でき、今までに報告された方法の中で最も速いことがこの方法の最大の特長である。

Research Products

• [Publications] Tada,J.: "Detection of the thermostable direct hemolysin gene(tdh)and the thermostable direct hemolysin-related hemolysin gene(trh)of Vibrio Parahaemolyticus by polymerase chain reaction" Mol.Cell.Probes. 6. 477-487 (1992)
• [Publications] Tada,J.: "Nonisotopic microtiler plate-based assay for detecting products of polymerase chain reaction amplification:application to detection of the tdh gene of Vibrio parahaemolyticus" Mol.Cell.Probes. 6. 489-494 (1992)
• [Publications] Kishishita,M.: "Sequence variation in the thermostable direct hemolysin-related hemolysin(trh)gene of Vibrio parahaemolyticus" Appl.Environ.Microbiol.58. 2449-2457 (1992)
• [Publications] 西渕 光昭: "PCRによる腸炎ビブリオの耐熱性溶血毒遺伝子および類似毒素遺伝子の検出法" 感染症(日本臨床特別号). 348-352 (1992)
• [Publications] 西渕 光昭: "PCR法を用いた下痢原性細菌の検出" 医学のあゆみ. 163. 172- (1992)