2004 Fiscal Year Annual Research Report
タンパク質間相互作用解析に用いる新規プロテインチップの開発
Project/Area Number |
04F04221
|
Research Institution | Yokohama City University |
Principal Investigator |
平野 久 横浜市立大学, 木原生物学研究所, 教授
|
Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
談 建中 横浜市立大学, 木原生物学研究所, 外国人特別研究員
|
Keywords | プロテインチップ / DLC基板 / 二次元電気泳動 / 質量分析 / タンパク質間相互作用 / ダイズ / 胚軸 |
Research Abstract |
本研究は、ダイヤモンド様炭素被膜処理基板(DLC基板)上に二次元電気泳動で分離されたタンパク質を電気泳動的に転写してプロテインチップを作製し、チップ上のタンパク質にタンパク質溶液を反応させた後、相互作用するタンパク質を質量分析装置で転写するハイスループットな方法を確立すること、また、確立された方法を用いて二次元電気泳動で分離されたダイズ種子胚軸タンパク質と相互作用するタンパク質を検出し、タンパク質-タンパク質相互作用マップを作成することを目的とした。まず、DLC基板にCy3で標識したタンパク質を転写し、これにCy5で標識した抽出液中のタンパク質を種々の条件で反応させた。また、抽出したタンパク質をリシルエンドペプチダーゼによって消化し、得られたペプチドをCy5で標識して反応させた。この実験で、タンパク質にタンパク質を相互作用させることはできなかったが、ペプチドを反応させることができることがわかった。タンパク質-タンパク質、あるいはタンパク質-ペプチド相互作用を解析するためには、まず、二次元電気泳動で分離されたタンパク質を同定しておく必要がある。そこで、ダイズ胚軸タンパク質を二次元電気泳動で分離し、約500のタンパク質をクマシーブルー染色によって検出した。分離されたタンパク質をゲル中でリシルエンドペプチダーゼにより消化した後、エレクトロスプレーイオン化四重極飛行時間型質量分析装置によってアミノ酸配列を分析した。そして、アミノ酸配列から各タンパク質の同定を行った。DLC基板上のタンパク質が同定できたので、タンパク質に相互作用するペプチドを質量分析装置で同定すれば、相互作用するタンパク質とペプチド両方を同定できると考えられた。
|
Research Products
(2 results)