Wnt2bによる網膜幹細胞の維持に関わる分子のスクリーニングと機能解析

2004 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 04J01307
• Research Institution: Kyoto University
• Principal Investigator: 久保 郁 京都大学, 生命科学研究科, 特別研究員(DC1)
• Keywords: 網膜 / 幹細胞 / Wntシグナル / スクリーニング

Research Abstract

様々な組織特異的な幹細胞は、増殖能・多分化能を持っており、他の分化した細胞種とは大きく異なった特徴をもつ。これまでの研究から、網膜幹細胞はWntシグナルによって未分化な状態に維持されていることが示唆されている。Wntシグナル経路では、転写因子TCF/LEFによって特定の標的遺伝子の発現が誘導されることから、実際に網膜幹細胞の維持に関わるのはこれら標的遺伝子であると考えられる。そこで網膜幹細胞を維持する分子機構を理解するために、私はWntシグナル経路の下流で働く分子をスクリーニング・同定し、その機能を解析することにした。
私はまず、Wntシグナルに反応している網膜細胞のcDNAを得ようと考えた。その方法として、網膜細胞のsingle cell PCRを行った。この方法により、単一細胞で発現している転写産物を、細胞内でのもともとの発現比を保ったまま、バイアスをかけることなく増幅することができる。96細胞についてsingle cell PCRを行い、網膜においてWnt-2bに反応して発現が上昇する遺伝子LEF1をマーカーとして、Wntシグナルに反応していると予想される細胞を選出した。この細胞から調整したcDNAと、LEF1を全く発現しておらず、かつ神経分化を開始し始めるころに発現されるNotch1を発現する細胞から調整したcDNAとの間でサブトラクションを行った。このようにしてサブトラクションを行ったcDNAのプールから、LEF1発現細胞のみで発現する候補クローンを選出し、それらの発現パターンをin situ hybridizationによって調べた。これまで得られたクローンの中は、Wntシグナルの下流で働くことがすでに報告されているConnexin 43が含まれていた。このConnexin 43は網膜幹細胞が存在する領域に特異的に発現していた。現在、このスクリーニングの規模をさらに広げている。