膜タンパク質活性のQCM上でのin situ解析系の構築

2005 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 04J04667
• Research Institution: Tokyo Institute of Technology
• Principal Investigator: 三友 秀之 東京工業大学, 大学院・生命理工学研究科, 特別研究員(DC1)
• Keywords: 水晶発振子 / 膜タンパク質の固定化 / 脂質二分子膜 / 振動数変化 / イオンチャネル

Research Abstract

膜タンパク質は、脂質膜中に存在することにより安定化され、本来の機能を発揮する。そのため、可溶化し、単離することは困難である。しかし、膜タンパク質は細胞膜を介したシグナル伝達や物質の輸送など生物にとって重要な機能を担っており、創薬のターゲットとしても注目されている。本研究では、膜タンパク質を脂質膜と共に機能解析することを目的に、水晶発振子を用いて膜タンパク質の分子認識(リガンドとの結合)とその詳細な動力学解析を測定できる系について研究した。
その結果、以下のような成果を得た。
1)水晶発振子の金基板上にアルカンチオールを用いて疎水的な自己組織化膜を調製し、そこにリン脂質を添加することによって平面二分子膜を調製した。そこに脂質で修飾されたタンパク質を添加することによって修飾された脂質部分を膜に挿入する形で固定化し、脂質膜上における膜表在型タンパク質の解析系を構築した。
2)膜貫通型タンパク質として、カリウムイオンチャネル(KcsA)を選び、プラスミドの調製、タンパク質の発現を行った。発現した膜タンパク質を界面活性剤に可溶化し、単離精製を行った。KcsA膜タンパク質はアビジンービオチン化法を用いて脂質膜基板への固定化に成功した。膜中のKcsAへのイオンチャネルブロッカーAgTx2ペプチドの結合を水晶発振子の振動数変化から追跡し、KcsAは脂質膜中に固定化しても活性を保っていることがわかった。