ミトコンドリア・プレ配列レセプターTom20によるプレ配列認識の構造的基盤

2005 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 04J06414
• Research Institution: Kyushu University
• Principal Investigator: 帯田 孝之 九州大学, 生体防御医学研究所, 特別研究員(PD)
• Keywords: X線結晶構造解析 / ミトコンドリア / Tom20 / 核磁気共鳴

Research Abstract

ミトコンドリアのマトリックスタンパク質は細胞質で合成された後、ミトコンドリアに輸入される。ミトコンドリアには輸送を司るタンパク質複合体が存在し、なかでもTom20は外膜上に存在してプレ配列に最初に結合する受容体として機能している。このTom20分子による詳細なプレ配列認識機構を解析するために、NMR構造をもとにフレキシブルなN末端とC末端を除いたコア構造に対応するTom20coreを作製し、X線結晶構造解析を行った。Tom20coreとプレ配列(アルコール脱水素酵素由来:ALDH)との結合は弱いため、プレ配列のC末端に人為的に導入したシステインを介してSS結合を形成させたTom20core-プレ配列複合体の結晶化を行った。Tom20coreは大腸菌BL21(DE3)を用いて発現させ、GS4Bカラムにより精製した。ALDHプレ配列はペプチド合成し、逆相カラムクロマトグラフィーにより精製した。Tom20coreとALDHプレ配列をpH8.0にて混合後、一晩室温に静置することによりSS結合を形成させた。その際に、リンカー部の配列を変えることにより、2つの異なる結晶系で結晶を得ることが出来た。一つは、YAGCリンカーで2.1Åの反射データ(空間群:C2、非対称単位中に7分子)を得た。もう一方は、AAGCリンカーで1.9Åの反射データ(空間群:P2_1、非対称単位中に2分子)を得ることに成功した。YAGCリンカー結晶中、及びAAGCリンカー結晶中でTom20core部分はほぼ同一の構造であった(rmsd<2.5Å)。Tom20に認識される部分のペプチド配列(R^<14>LSRLL^<19>)はαヘリックス構造をとることがわかった。