2005 Fiscal Year Annual Research Report
RNA干渉によるニワトリミオスタチンのジーンターゲティング
Project/Area Number |
04J06796
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Research Institution | Kyushu University |
Principal Investigator |
佐藤 文規 九州大学, 大学院・農学研究院, 特別研究員(DC1)
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Keywords | ミオスタチン / GDF-8 / ニワトリ胚由来筋芽細胞 / RNA interference / Differential Display / Smad |
Research Abstract |
ニワトリ12日胚よりPercoll density gradient centrifugation methodを用い筋芽細胞を採取し、これらのin vitroで内因性のミオスタチン(GDF-8)の発現を伴って増殖・分化する筋芽細胞に、GDF-8を標的としたsiRNAをlipofection法により導入した。導入後GDF-8のmRNAおよびタンパク質に明らかな減少がRT-PCR法およびwestern blottingにより確認された。また、GDF-8の活性をpGL(CAGA)_<10>を用いたluciferase assayにより調べたところ、明らかに抑制されていることが確認された。以上の結果より、GDF-8を標的としたsiRNAを筋芽細胞にlipofection法により導入することにより、内因性のGDF-8の機能を抑制した状態で増殖・分化させることが可能となった。GDF-8の機能が抑制された筋芽細胞は導入されていないものと比較すると明らかな形態的な差を生じ、その差の一つとして多核化し、その結果形成される筋管細胞の割合がGDF-8の機能が抑制されていないものに比較して高いことが確認された。このGDF-8のmRNAの発現に減少が確認されたものを用いて、Differential Display法によりGDF-8の機能に関与する遺伝子の探索を行った。その結果、GDF-8の発現抑制により発現量が変化する遺伝子がいくつか得られた。このうち、いくつかの遺伝子に関して全長をクローニングし、過剰発現実験およびWISHに用いるプローブ作成用のplasmidを作製した。
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