2004 Fiscal Year Annual Research Report
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04J07840
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| Research Institution | Osaka University |
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Principal Investigator |
橋本 吉民 大阪大学, 大学院・生命機能研究科, 特別研究員(PD)
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| Keywords | DNA複製チェックポイント / ATR-Chk1経路 / Dpb11 / Cut5 / TopBP1 / アフリカツメガエル無細胞複製系 |
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| Research Abstract |
DNA複製チェックポイントは、複製進行をモニターする機構であり、正常な複製進行が阻害されたときに、ATR-Chk1のキナーゼ経路を活性化し細胞周期めG2/M期への進行を抑制する働きを持っている。複製装置の構成因子であるDNAポリメラーゼ_ε(以下Pol_ε)とその関連因子であるDpb11/Cut5/TopBP1(以下、Cut5)は、複製チェックポイントに関与すると考えられているが、チェックポイント特異的に機能する因子と異なり、Cut5は複製開始、Pol_εは複製進行にそれぞれ必要であるため、複製チェックポイントたおける機能の解析は困難であり、直接的な必要性は不明であった。本年度の研究では、アフリカツメガエル卵抽出液を用いた無細胞複製系によりPol_ε、Cut5の必要性を検討した。Cut5非存在下で複製進行が起きる系を開発し、複製阻害剤による効果を調べた結果、Cut5は複製開始とは独立してChk1め活性化に必要であった。さらにツメガエルCut5の欠失変異体を作成して機能ドメインを解析したどころ、酵母ホモログと相同性の高いN末端側領域のみで複製開始が起きるが、このとき複製を阻害してもChk1の活性化が起きないこと、そこに分離したC末端側領域を添加するとChk1活性化が回復することを見い出した。また、ATR-Chk1経路を抽出液中で活性化させる合成DNA基質を用いた場合にも、Cut5のC末端側領域が必要であること、この領域内にDNA基質と結合するドメインがあることを明らかにした。とれらの結果は、高等真核生卿ではCut5のC末端領域が複製モニター機構においてセンサーとして機能していることを示唆する。一方、Pol_εは免疫除去してもChk1活性化が起きたごとから、チェックポイント活性化には直接的な関与がないと考えられるが、複製阻害時における複製装置の安定化への関与を示唆する結果を得ている。
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