2004 Fiscal Year Annual Research Report
リコンビナーゼ標的となる新規レポーター遺伝子の開発による感染過程特異遺伝子の同定
Project/Area Number |
04J08432
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Research Institution | Osaka University |
Principal Investigator |
三島 絵里奈 大阪大学, 理学研究科, 特別研究員(DC1)
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Keywords | ミヤコグサ / 根粒菌 / 共生 / 窒素固定 / プロモータートラップ / RIVET / 発現解析 |
Research Abstract |
マメ科植物との共生を成立させる時に、根粒菌内で発現している遺伝子を経時的・空間的に捕らえるため、RIVET (Recombinant in-vivo Expression Technology)法の二次レポーターを改良することにより、RIVET法の拡張を行っている。改良二次レポーターは、リコンビナーゼ発現前にはゲンタマイシン耐性でカナマイシン感受性、リコンビナーゼの発現後には、薬剤耐性が切り替わる長所を持つことになる。そこで、カナマイシン耐性遺伝子内の4箇所に、site-direct-mutagenesisを用いて制限酵素サイトを導入した。さらに、この部位に味噌・醤油酵母R-リコンビナーゼの認識配列(res)に挟まれたゲンタマイシン耐性遺伝子のカートリッジを挿入した。これを、リコンビナーゼ発現プラスミドとともに大腸菌に導入し、系の動作を確認したととろ、4種類全ての二次レポーター候補で、リコンビナーゼ由来の組み換えが確認された。さらに、2種類の二次レポーター候補では、カナマイシン耐性遺伝子の発現が確認された。しかし、得られたカナマイシン耐性遺伝子の活性が、res配列未挿入のカナマイシン耐性遺伝子と比べて約1/5以下に低下していた。そこで、さらに強力にカナマイシン耐性を付与する遺伝子を得るため、ゲンタマイシン耐性遺伝子の挿入位置の調整、resからlox、FRTなどの他のリコンビナーゼ認識配列への変更など、更なる改良を行っていく予定である。
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