昆虫サイトカインGBPの作用機構の解明:GBP受容体の単離と高次構造解析

2005 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 04J08900
• Research Institution: Saga University
• Principal Investigator: 織田 康則 佐賀大学, 農学部, PD
• Keywords: サイトカイン / 血球活性化 / 生理活性ペプチド / 受容体

Research Abstract

アワヨトウ幼虫から単離された昆虫サイトカインGrowth-blocking peptide(GBP)の作用機構の解明、及びGBP受容体の同定を目的として、GBPの作用によりリン酸化される血球タンパク質の解析を行った。その結果、GBP作用後1分で急速にチロシンリン酸化が生じる分子量77kDaの膜タンパク質(P77)を発見した。昨年度、P77を精製しcDNAの単離をした結果、p77はシグナルペプチド配列、細胞外領域、膜貫通領域、細胞内領域からなる一回膜貫通型の新規の受容体様分子と推測された。本年度は以下の項目を実施し結果を得た。
1、P77の組織特異的発現様式
RT-PCR法、イムノブロット法を用いて、血球、外皮、脂肪体、マルピーギ管、中腸、脳での発現を調べた結果、血球、脳で特異的に発現していた。
2、GBPとの結合解析
S2細胞にP77の全長を含む発現ベクターを導入し、恒常的にP77を発現する細胞系を構築した。これを用いて^<125>I-GBPの結合を解析した結果、特異的結合は見られなかった。現在GBPとの結合には他分子が協調的に関与していると推測している。
3、細胞外領域の発現系の構築
他分子と相互作用ができると推測される細胞外領域の高次構造を解析する目的で、大腸菌を用いた多量発現系に取り組んだ。P77の細胞外領域に相当する部分をGST融合タンパク質として発現させ、可溶化タンパク質として得られる最適条件を検討し、数ミリグラムを精製できる方法を構築した。
4、ヨトウガからの相同分子の同定
近縁のヨトウガ血球より、p77相同分子をRT-PCR、3'-RACE、5'-RACE法を用いて同定した。得られた分子は、557アミノ酸残基からなり、アワヨトウp77との相同性は61%であった。現在、この2分子の保存領域を利用してトランスジェニック操作が可能なカイコガからの相同分子の単離にも取り組んでいる。