2004 Fiscal Year Annual Research Report
二本鎖DNA切断修復系及び塩基除去修復系の連係と欠失及び挿入型変異の関連
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04J11804
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| Research Institution | Tokyo Medical and Dental University |
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Principal Investigator |
柴田 淳史 東京医科歯科大学, 難治疾患研究所, 特別研究員(DC1)
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| Keywords | Parp-1 / 塩基除去修復 / 非相同末端結合 / 二本鎖DNA切断 / DNA日本鎖切断修復 / 欠失 / 挿入 / 転移型変異 / DNA-PK |
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| Research Abstract |
非相同的組換え(NHEJ)経路の異常を介する挿入型変異の機構を解明するために、ポリ(ADP-リボース)合成酵素(Parp-1)欠損細胞の細胞系及び細胞粗抽出液系を用いて、種々のDNA傷害後の二本鎖DNA切断とその修復効率、変異について解析を行っている。Parp-1は塩基除去修復(BER)系の重要な構成因子である。Parp-1欠損によるBERの停滞から二本鎖DNA切断、そしてNHEJ経路への乗り換え、欠失/挿入型変異について調べ、NHEJ/BERの異常と欠失/挿入/転位型変異の関連性を明らかにしようと試みている。
Parp-1のNHEJ型修復への関与を検討するため、ウミシイタケルシフェラーゼ遺伝子をコードするプラスミドpRLをRarp-1欠損マウス胎仔線維芽細胞(MEF)に導入して細胞レベルでend joining (EJ) assayを行った。その結果、正確及び不正確を含むEJ型修復効率はParp-1^<-/->とParp-1^<+/+>MEFにおいて有意差は認められなかった。従って、Parp-1欠損は二本鎖DNA切断を有するDNAを基質としたEJ型修復の効率及びエラー頻度に影響を与えないと考えられる。次に、アルキル化剤処理後のBER系からDNA切断を介してのNHEJ経路への移行の可能性を調べるため、パルスフィールドゲル電気泳動を用い、Parp-1欠損MEFをメチルメタンスルホン酸処理後、DNA切断量の変化を検討した。Parp-1^<-/->MEFにおいてParp-1^<+/+>MEFと比較し、一本鎖DNA切断だけではなく二本鎖DNA切断量の上昇が認められた。また、二本鎖DNA切断修復におけるDNA-dependent protein kinase (DNA-PK)及びParp-1の相互作用を検討するため、DNA-PK及びParp-1両遺伝子変異を有する自然不死化MEFを各々樹立した。現在、DNA-PK遺伝子変異のみを有するMEFを作製中であり、今後はNHEJ効率及び変異スペクトルを解析することによって、DNA-PKとParp-1の相互作用を明らかにする。
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