組換え中間体Holliday構造に作用する組換え修復酵素の構造と機能

1993 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 05270210
• Research Institution: Osaka University
• Principal Investigator: 岩崎 博史 大阪大学, 微生物病研究所, 助手 (60232659)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 品川 日出夫 大阪大学, 微生物病研究所, 教授 (40029799)
• Keywords: 相同組換え / DNA修復 / ホリデー構造 / ブランチマイグレーション / ホリデーリゾルベース / エンドヌクレアーゼ / RuvABタンパク質 / RuvCタンパク質

Research Abstract

相同組換えの中間体と考えられているホリデー構造は二分子の二重鎖DNAがそれぞれ相補鎖を交換してX字型構造となった構造をしている。我々は、このホリデー中間体をプロセスする酵素としてRuvAB複合体、RuvCエンドヌクレアーゼを初めて同定し、解析している。RuvAB複合体は、ATPのエネルギーを利用してホリデー構造のジャンクション位置の移動(ブランチマイグラション)を促進し、組換え領域を拡大すること、RuvCはホリデー構造のジャンクション部位を切断し組換え体を生じる際に働くエンドヌクレアーゼであることなどを証明してきた。
本研究では、RuvABブランチマイグラーゼとRuvCエンドヌクレアーゼの作用機序を明かにすることを一つの目的とし、合成オリゴヌクレオチドで作成したHolliday構造のモデル基質を用いて解析した。その結果、RuvCエンドヌクレアーゼについて以下のことを明かにした。すなわち、RuvCのHollidayジャンクション対する結合と切断反応は、独立したモードである。また、相同性を持つ場合のみX字型及びY字型DNAが切断されるということから、合成Holliday構造の取り得る特殊なトポロジーの場合のみRuvCの基質となると考えられる。このことは、真のHollidayジャンクションの構造を理解するうえで重要なキーとなると思われる。また、RuvAB複合体のコンポーネントは、RuvAは4分子、RuvBは2分子であることを明かにした。更に、詳しく反応メカニズムを解析するために、RuvA,RuvB,RuvCの変異体を多数単離した。現在これらの変異体の解析を進めている。
真核高等生物でのRuvホモログの遺伝子のクローニングは、もう一つの研究目的であるが、そのために、遺伝子ライブラリーを用意した。現在、プロービングのための条件検討や、ストラテジーを検討しているところである。

Research Products

• [Publications] Shiba,T.,et al.: "Escherichia coli RuvA and RuvB proteins involved in recombination repair:physical properties and interactions with DNA." Mol.Gen.Genet.237. 395-399 (1993)
• [Publications] Shinagawa,H.,et al.: "SOS-inducible recombination repair genes:Products of the ruvA,ruvB,and ruvC genes are Holliday junction specific enzymes." Shima,A.et al.,editors.“Frontiers of Photobiology"Elsevier Science Publishers. (図書総頁528頁). 323-327 (1993)
• [Publications] Shida,T.,et al.: "Structural analyses of synthetic immobile Holliday junction" Nucleic Acids Symposium Series. 29. 181-182 (1993)
• [Publications] Takahagi,M.,et al.: "Structural requirement of substrate DNA for binding to and cleavage by RuvC,a Holliday junction resolvase." J.Biol.Chem.(印刷中). (1994)