微生物のホスホリパーゼの一次構造における活性部位の分子生物学的解析

1995 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 05454571
• Research Institution: Nagoya City University
• Principal Investigator: 池沢 宏郎 名古屋市立大学, 薬学部, 教授 (40080163)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 小林 とも子 名古屋市立大学, 薬学部, 助手 (70214533) ; 塚本 喜久雄 名古屋市立大学, 薬学部, 講師 (20183478) ; 田口 良 名古屋市立大学, 薬学部, 助教授 (20080210)
• Keywords: ホスホリパーゼB / スフィンゴミエリナーゼ / PI特異的ホスホリパーゼC / Penicillium notatum / Bacillus cereus / Bacillus thuringiensis / 酸素蛋白質一次構造 / 酵素活性部位

Research Abstract

1.Bacillus cereusのスフィンゴミエリナーゼの一次構造と活性の相関の解析
PDBのデータに基づき、スフィンゴミエリナーゼの一次構造を既知の蛋白質のものと比較した結果、本酵素の構造は、牛膵デオキシリボヌクレアーゼI(DNase I)と相同性があることが示された。X線結晶解析により判明しているDNase Iの三次構造上に本酵素の一次配列を3D-1D法により乗せて調べた結果、151,296位のヒスチジン、295位のアスパラギン酸が活性に重要である可能性が示された。そこで、ヒスチジンをアラニンに、アスパラギン酸をグリシンに変えた3つの変異体酸素を、部位特異的変位により作製し検討したところ、これらのアミノ酸が触媒活性および溶血活性に必須であることが明らかとなった。
2.真菌Penicillium notatumのホスホリパーゼBのGPIアンカー蛋白質としての構造特異性および遺伝子の発現
本酵素の遺伝子を大腸菌に導入し、抗体で調べた結果、不活性型の蛋白質として発現していることが確認された。また、GC-MSによる分析から、本酵素が分子内にイノシトールを含むGPIアンカー蛋白質であることが示された。一方、本酵素がスフェロプラストの膜表面上で自己のアンカーを分解し、自己触媒的に膜から遊離することを明らかにした。
3.Bacillus thuringiensisホスファチジルイノシトール特異的ホスホリパーゼCの大量生産系の構築
本酵素遺伝子をBacillus brevisのホストーベクター系で発現させ、蛋白質としてもとの菌の培養の約500倍の収率で得ることが出来た。

Research Products

• [Publications] Hiro-omi Tamura: "Mutation in aspartic acid residues modifies catalytic and haemolytic activities of Bacillus cereus sphingomyelinase" Biochemical Journal. 309. 757-764 (1995)
• [Publications] Hiroh Ikezawa: "Studies on the active sites of Bacillus cereus sphingomyelinase-Substitution of some amino acids by site-directed mutagenesis" Amino Acids. 9. 293-298 (1995)
• [Publications] 山田 敦子: "Site-directed mutagenesisによるB.cereus由来sphingomyelinaseの活性部位に関する研究" 生化学. 67. 949-949 (1995)
• [Publications] 田村 悦臣: "脂質生化学研究37巻" 日本脂質生化学研究会, 3 (1995)