アミノ酸異性化酵素由来合成DNAを用いる食品生菌数の迅速測定法に関する研究

1994 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 05558002
• Research Institution: Nara Women's University
• Principal Investigator: 横井川 久己男 奈良女子大学, 生活環境学部, 助教授 (60230637)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 遠藤 金次 聖母女学院短期大学, 生活科学科, 教授 (20031643) ; 河合 弘康 奈良女子大学, 生活環境学部, 教授 (80026525)
• Keywords: アラニンラセマーゼ / 食品衛生 / 細菌検査 / ポリメラーゼチェインリアクション

Research Abstract

食品の一般細菌検査をアラニンラセマーゼの遺伝子を指標として、迅速かつ特異的に行うことを目的とし、昨年度の研究成果を踏まえて、本酵素遺伝子の活性中心Lys残基、およびHis168残基を含む高い保存領域に対応する数種のオリゴヌクレオチドを合成し、これをプライマーとして、ポリメラーゼチェインリアクション(PCR)により、本酵素遺伝子断片を特異的に増幅する条件を検討した。プライマーのミックス度が高いもの、及び、イノシンの含有量が多いプライマーでは、アラニンラセマーゼ遺伝子断片の増幅は見られなかったが、既知アラニンラセマーゼ遺伝子のコドン利用頻度を考慮して設計したプライマーの使用やアニーリング温度等の検討から、特異的に約400bpのDNAが増幅される条件を確立した。得られたPCR産物のDNAシーケンシングを行ない、その塩基配列からPCR産物が確かにアラニンラセマーゼ遺伝子断片であることを確認した。確立したPCRの条件に従い、各種低温菌、常温菌、好熱菌由来の染色体DNAを鋳型としたPCRを行なったところ、同様のサイズのDNAが増幅され、本PCR法は、各種細菌の検出に有用であることが明らかとなった。また、実際に、食品に、細菌を加えて、本PCR法による検出を試みたところ、牛乳やミネラルウォーター中の細菌1細胞が検出可能であった。

Research Products

• [Publications] Kumio Yokoigawa: "Thermolabile alanine racemase from a psychrotroph:purification and properties." Biosci.Biotech.Bioeng.57. 93-97 (1993)
• [Publications] Kumio Yokoigawa: "Enantioselective Synthesis of N-acetyl-L-methionine with Aminoacylase in Organic Solvent." Appl.Microbiol.Biotechnol.42. 287-289 (1994)