ウイルスを用いたin vivoでの神経細胞への遺伝子導入法の開発とその応用

1993 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 05558094
• Research Institution: Wakayama Medical University
• Principal Investigator: 野口 光一 和歌山県立医科大学, 医学部, 助教授 (10212127)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 河合 良訓 和歌山県立医科大学, 医学部, 講師 (80211861) ; 刀祢 重信 和歌山県立医科大学, 医学部, 助手 (70211399) ; 北元 憲利 姫路短期大学, 食物栄養学科, 教授 (70145928) ; 宮本 博行 和歌山県立医科大学, 医学部, 教授 (90029778) ; 仙波 恵美子 和歌山県立医科大学, 医学部, 教授 (00135691)
• Keywords: ウイルス / pseudorabies / トランスフェクション / 遺伝子導入 / トレーサー / 後根神経節 / ペプチド

Research Abstract

本年度は、Pseudorabies virus(PrV)の変異株(Bartha株)への遺伝子導入の手法を確率するため、マーカーとして用いるbeta-galactosidase(beta-Gal)遺伝子の効果的な導入法について種々の検討を行った。
まず、ゲノミックPrVよりSphI-fragment(gX,gp50,gp63,gIなどの糖蛋白をコードする領域)を切断し、pFBI-1に導入。gXのBamHI siteにE.Coliのbeta-Gal geneのBamHI fragmnetを接続した(plasmid DNA)。PrVはpig kidney cell(PK cell)に接続して増殖させ、型どおりviral DNAを抽出した。PrV DNA(2-5ug)と、plasmid DNA(10-15ug)の混合液に2M CaCl_2と2xHBSを加えて沈澱を形成させ、その液を37℃で4時間培養した。Glycerol shockを行った後、更に完全なCPEが形成されるまで37℃で培養した。ウイルスを含む上清をVERO cell上に撒き、Bluo-Galにて青染するプラークをクローニングし、gX-beta-Gal fusion geneを取り込んだPrVを得ることに成功した。この様なco-transfectionによるmutant virusはPK cellよりもVERO cellにおいてよく増殖することが明らかになり、mutant virusの精製をより効果的に行うことができた。
次にこのmutant virusをラットの皮膚に接種し、後根神経節でのbeta-Galの発現を観察することができた。今後これをトレーサーとして用いることにより、従来のトレーサー法では明らかにされていなかった神経回路網の解明を行う。また、各種ペプチド前駆体の遺伝子や細胞性癌遺伝子、あるいはそれらのアンチセンス遺伝子の導入を行い、知覚伝達系におけるこれらのペプチドや細胞性癌遺伝子の役割について検討を加える予定である。

Research Products

• [Publications] Noguchi,K.et al.: "Quantification of axotomy-induced alteration of neuropeptide mRNAs in dorsal root ganglion neurons....." Journal of Neuroscience Research. 35. 54-66 (1993)
• [Publications] Senba,E.et al.: "Differential expression of fos family and jun family mRNAs in the rat hypothalamo-pituitary-adrenal axis after immobilization" Molecular Brain Research. (in press).
• [Publications] 仙波恵美子: "細胞培養ハンドブック 分担:培養細胞のin situ hybridization法" 鈴木利光 (中外医学社), 280 (1993)