2006 Fiscal Year Annual Research Report
大脳皮質可塑性の引き金ニューロン群における単一細胞遺伝子プロファイリングと遺伝子ネットワーク解析
Project/Area Number |
05F05880
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Research Institution | The Institute of Physical and Chemical Research |
Principal Investigator |
CARNINCI Piero 独立行政法人理化学研究所, 林崎生体分子機能研究室, 先任研究員
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Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
PLESSY Charles 独立行政法人理化学研究所, 林崎生体分子機能研究室, 外国人特別研究員
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Keywords | ゲノムのgenomic / トランスクリプトームtranscriptome / 分子生物学molecular biology / プロモーターpromoter / シーケンシングsequencing / cDNA / 単一細胞single cell / 逆転写酵素 |
Research Abstract |
平成18年度に微量サンプルからCAGEタグ(5'末端配列タグ)を作成する単純手法の開発を確立した。この手法を効果のあるものにするにはそれぞれの段階で高収率を得る必要がある。したがって、一本鎖連結、および逆転写という2つの主要な反応に関する知識の増加にかなりの努力をした。今年の予算はほとんど酵素、デオキシおよび、リボヌクレオチド、また精製キットの購入に使った。 RNAリガーセは低効率で、最高でも約20%と言う低いものと報告されています。 典型的なRNAライゲーションは、20年前に確立された実験同様、低温、高ATP濃度下で実行される。反応バッファを変更した後に、我々はRNAを破損することなく、温度と反応時間を上げて、またATP濃度を抑えることによって、効率を倍にすることができた。(ATPは必要だがRNAと活性部位において競合するように抑制的である)。この実験(結果)は人工RNAにおいてもたらされた。我々は全RNAサンプルにこのプロトコルを適合させようとしています。 逆転写酵素,その頑強な酵素が現代生物学において広く使われたが、驚いたことに逆転写に関するいくつかの重要な特色が研究者によって無視されていた。特に、反応がプライマーなしで起き、そしてそれが我々の場合、逆転写の後のcDNAsを増幅するためのプライマーによってもたらされたたシーケンスに頼っているが故に、非常に問題であると言うことに注目した。現在の努力は大部分のcDNA分子が逆転写プライマーによってもたらされるのか、または全RNA中の内在性RNAによるものではないのか、の確証に焦点を合わせています。 この問題の解決が単一チューブCAGEライブラリ開発を完了させ、生物学的関連サンプルからライブラリを作る出すことになる。
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