2006 Fiscal Year Annual Research Report
新しい原理に基づく電子移動型バイオセンサの基盤研究
Project/Area Number |
05J01937
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Research Institution | Kyoto University |
Principal Investigator |
藤枝 伸宇 京都大学, 次世代開拓研究ユニット, 科学技術振興助手
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Keywords | ヒスタミン脱水素酵素 / アミン脱水素酵素 / ヒスタミンセンサ / 分子内電子移動 / 基質認識機構 |
Research Abstract |
現在までに我々は電子移動型バイオセンサの基本原理について研究を行ってきた。安全かつ信頼性の高い食品・水質管理および在宅医療などにおけるバイオセンサの役割は非常に大きい。そこでアミン脱水素酵素を例として取り挙げ、高感度・高選択的なバイオセンサ作製を視野にいれた研究を行っている。昨年度、酵素機能、特に基質認識・電子伝達機構を追及し、それに基づいたより戦略的な酵素の改変を行ってきた。具体的にはG268D/D269C、Y180F、G268D/D269C/Y180F変異体を作製し酵素活性評価を行った。また、野生株由来のヒスタミン脱水素酵素についてはその酸化還元コファクタとのひとつである6-S-CysteinylFMNの酸化還元挙動を新規な分光電気化学法である無隔膜バルク電解法により評価した。本年度はそれらの研究をより押し進め、もう一つの酸化還元コファクタである鉄硫黄クラスターの酸化還元電位をITO電極を用いて詳細に検討した。その結果、pH7付近においてはFMNとほぼ変わらない値を示し、pH>9においては急激に値が変化し負にシフトすることがわかった。これらのことより、鉄硫黄クラスターはあまり電子移動に関与していないことが示唆される。これはヒスタミン脱水素酵素に非常に類似した酵素であるトリメチルアミン脱水素酵素において提唱されている鉄硫黄クラスターの役割とまったく異なる結果となった。また、G268D/D269C/Y180F変異体についても同様に電気化学的解析を行なったところ、ほぼ野生株由来の酵素と同じ電位vs.pHプロファイルを示した。これらのことより、基質阻害には分子内の電子移動はほとんど関与しておらず、FMN近傍に阻害サイトが存在することが示唆された。一方で、オスミウム錯体ポリビニルポリマーを用いてヒスタミン脱水素酵素を電極に固定化することで感応膜を作製し、ヒスタミンセンサを作製した。酸化還元電位が酸化還元コファクタの電位と非常に近いオスミウム錯体を用いて、動作電位を下げることに成功し、0.1Vvs.SHEにおいてμMオーダーでシグナルが観測された。また、動作電位を下げることでアスコルビン酸などの電極活性物質の影響を最小限にできることがわかった。
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Research Products
(1 results)