2006 Fiscal Year Annual Research Report
がん細胞およびその遺伝子異常を検出するイメージング分子の開発
Project/Area Number |
05J02228
|
Research Institution | Kyoto University |
Principal Investigator |
山田 久嗣 京都大学, 工学研究科, 特別研究員(DC1)
|
Keywords | 光機能性核酸 / DNAメチル化 / 遺伝子変異検出 |
Research Abstract |
前年度までに、ナフトキノン誘導体を導入した光機能性核酸および標的となるメチル化DNAとの二重鎖に対して光反応を調べた結果、DNA内の5-メチルシトシン(mC)が一電子酸化されたのち、mC部位においてDNA鎖切断が選択的に起こることを見いだしている。一方、シトシンの場合には酸化的切断が生じないため、DNA鎖の切断をモニターすることによりmC変異部位を簡便に検出できることを明らかにした。今年度は、さらに、より簡便かつ高感度検出系への展開、拡張を目指して、上述のmC部位特異的なDNA鎖切断を蛍光発光によるmC検出システムへと応用した。一般的に、微量の遺伝子を検出するためのPCR法による遺伝子増幅反応を5-mCに適用できないため、別法による高感度検出が求められる。そこで、PCR非依存的な遺伝子解析手法であるインベーダー法を改変し、上述の光反応を組み合わせた新しい高感度mC検出系を設計した。上述の光反応によってターゲットDNA(p53がん抑制遺伝子;exon 8部分配列)をmC部位で切断した後、インベーダー法のFRETプローブを加え、Flap endonuclease(FEN)にて処理した。その結果、FRETプローブの酵素による切断が進行し、非常に強い蛍光発光が観測された。一方、同様の反応を非メチル化DNAに対して行ったところ、発光はほとんど観測されなかった。これらの結果は、メチル化DNAの光反応によって形成されるDNA断片とFRETプローブのハイブリッドのみが、FENの基質として機能したことを示している。以上のことから、本システムを利用することによって、DNAメチル化を蛍光発光により検出しうることを実証できた。さらに、このシステムの検出感度を測定したところ、インベーダー法によるシグナル増幅の結果、sub-femt omolレベルのメチル化DNAを検出し得ることがわかった。
|
Research Products
(1 results)