2005 Fiscal Year Annual Research Report
骨格形成担当細胞分化決定転写因子RunX2のDNA結合共役因子の網羅的解析
Project/Area Number |
05J06774
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Research Institution | Nagasaki University |
Principal Investigator |
藤田 隆司 長崎大学, 大学院・医歯薬学総合研究科, 特別研究員(SPD)
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Keywords | Runx2 / 共役因子 / 網羅的 |
Research Abstract |
採用前年度にRunx2とPI3Kシグナルの共役解析から、リン酸化非依存的なmytAktによるRunx2のDNA結合活性機構の存在を示唆する結果を得ていたので、これを含めRunx2の共役因子を同定する実験を試みた。 Runx2モノクローナル抗体がRunt domainとC端の転写制御ドメインを認識するため、より網羅的に解析するために、N端にFLAGエピトープを融合したFLAG-Runx2を作製し、これを強発現させるためのアデノウイルスを作製した。これを用いて、抗FLAG抗体による免疫沈降産物を評価するための条件検討を行った。この実験系維持には大量のウイルス作製を必要とし、FLAG-Runx2と共役するわずかな因子探索にはより多くの試料から調整することが望ましいと考えられた。従って条件を設定した後、FLAG-Runx2を強発現する安定発現細胞株を樹立し大量の試料調整を必要とする。十分な試料の回収のため株化細胞を用いることとし、Runx2が本来発現している軟骨細胞と骨芽細胞の株化細胞であるATDC5とMC3T3-E1を用いてスクリーニングする予定である。より効率的にスクリーニングするために、IRES-GFP配列を融合したレトロウイルスを用いてクローン選別を行う予定である。同時に、Runx2の分化誘導作用としてアルカリフォスファターゼ活性によりスクリーニングも行う。 また、融合タンパクは本来のRunx2による転写活性及びDNA結合活性を保持していた。以上の成績はFLAG-Runx2を強制発現したトランスジェニックマウスを作成した場合も同様にin vivoから試料を調整できる可能性を強く示唆するものとなった。 別途、GST融合Runx2を大腸菌で作製し、網羅的な解析手段として準備を行っている。
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Research Products
(1 results)