2005 Fiscal Year Annual Research Report
ラット脳幹孤束核における神経伝達物質放出制御機構の解明
Project/Area Number |
05J06865
|
Research Institution | Jikei University School of Medicine |
Principal Investigator |
繁富 英治 東京慈恵会医科大学, 医学部, 特別研究員(PD)
|
Keywords | 神経伝達物質放出 / シナプス伝達 / 節状神経節 / 迷走神経 / 一次求心性線維 / RNA干渉 / 遺伝子導入 / eGFP |
Research Abstract |
本年度は、節状神経節細胞への遺伝子導入およびタンパク質発現阻害を行った。 遺伝子導入 幼若ラットを麻酔下に頚部切開し、節状神経節を露出し、刺入しやすいように加工したガラスピペットにより、EGFP発現ベクターを2-3μL節状神経節内に注入した。注入後5分以内に、神経節鞘周囲を導電性ゲルで満たし、特注の双極電極を用いた電気穿孔法でEGFP発現ベクターを細胞内に導入した。48時間後に節状神経節を摘出・固定し、EGFP発現細胞の分布および障害細胞の分布などに基き、導入方法を評価し、注入する量および部位に加えて、電気穿孔法のさまざまなパラメータの最適条件を得た。導入19日後に脳幹を摘出し、EGFP発現を示す一次求心性線維が脳幹孤束核まで到達していることを確認した。 siRNAによるタンパク質発現阻害 遺伝子導入と同様の方法で、蛍光標識siRNAを導入し、直後、節状神経節を摘出し、蛍光標識siRNA分子の神経節細胞内への取り込みを確認した。節状神経節細胞での発現が確認されているアデノシンA_1受容体のmRNAに対する合成siRNA 1-2μLを導入した。導入1日〜14日後、節状神経節を摘出し、RNAを抽出し、定量RT-PCR法によりmRNA発現量を定量した。その結果、対GAPDH発現率が導入3-7日後で、非手術神経節の15%以下まで低下し、mRNA発現の大幅な抑制が確認された。 来年度は、アデノシンA_1受容体発現抑制の孤束核シナプス伝達へ及ぼす影響を、スライスパッチクランプ法により評価する。また、P2X受容体のタンパク質発現阻害を行い、孤束核における伝達物質放出に及ぼす影響を評価し、公表する予定である。
|
Research Products
(5 results)