2005 Fiscal Year Annual Research Report
非アポトーシス型細胞死変異株の分離とその分子機構の解析
Project/Area Number |
05J09346
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Research Institution | Osaka University |
Principal Investigator |
遊佐 宏介 大阪大学, 医学系研究科, 特別研究員(PD)
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Keywords | アポトーシス / オートファジー / ブルーム症候群 / Bak / Bax |
Research Abstract |
プログラム細胞死は、細胞の形態形成や恒常性維持に必須の機能である。ミトコンドリアにおけるアポトーシス促進因子Bax,Bak二重変異マウスの解析においてp53依存性のアポトーシスが阻止されることが報告されたが、当研究室の詳細な解析の結果、実際にはオートファジー様細胞死が誘導されていることが見いだされた。オートファジーの分子機構の解析は出芽酵母変異体の解析により進展しつつあるが、ほ乳類では未知の部分が大きい。本研究では、Bax,Bak二重変異と両アレル変異を導入できるBloomシステム(Nature 429:896)とを組み合わせ、オートファジー様細胞死変異株を分離し、関連遺伝子のスクリーニングを行うことを目的としている。 本年度は、まず、Bloomシステムが導入されたES細胞にBax,Bak二重変異を導入することより開始した。Bax,Bakのターゲッティングベクターを構築し、順次、ターゲッティングを行っている。これまでにBakのノックアウトが終了し、サザンブロット解析により正しくゲノムの改変が行われていること、またウェスタンブロット解析によりBakタンパク質が完全に消失していることを確認した。現在Baxノックアウトを進めている。 また、変異導入を行うため、新たなジーントラップ型レトロウイルスを構築した。ジーントラップによる変異導入には、変異株取得後の原因遺伝子の同定を簡略に行える利点がある。Bloomシステムに最適なジーントラップ型レトロウイルスとしてLRT領域にFRT部位を導入し、変異株取得の後、Flp組換え酵素を発現させることで復帰株を作製できるよう工夫した。実際にウイルスを作製してみたところ、十分に高いタイターのウイルスを作製でき、また遺伝子とラップによる変異導入、また復帰株の作製が可能であることを、Hprt遺伝子を指標としたスクリーニングより確認した。 次年度においては、Baxノックアウトを完了させ、スクリーニング系の確立を目指す。また、両アレル変異の導入効率を向上させるためBloomシステムの改善を目指す。
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