1995 Fiscal Year Annual Research Report
糸状菌結晶α-グルコシダーゼの基質認識機構および糖鎖構造の解析
Project/Area Number |
06453164
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Research Institution | Hokkaido University |
Principal Investigator |
千葉 誠哉 北海道大学, 農学部, 教授 (30001449)
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Keywords | 全一次構造 / ジフルフィド結合 / 第二次アイソトープ効果 / Aspergillus niger |
Research Abstract |
本研究は、糸状菌の産生する学術的かつ産業的にも重要な分泌酵素の一つであるα-グルコシダーゼの基質認識や構造の解析を行い、その目的の一つである糖質分解酵素の微視的反応機構の合理的かつ統一的なモデルの構築を意図して推進され、本年度に関しては以下の成果が得られた。 1.糸状菌結晶α-グルコシダーゼの水解反応に対する第二次アイソトープ効果‐‐‐グルコアミラーゼの縮合反応を用い、[1-^2H]-グルコースから[1,1′-^2H]-イソマルトースを調製した。その構造を確認後、本酵素を作用させ、速度パラメーター(K_m,k_0)を求めた。ノンラベルのイソマルトース([1,1′-^1H]-イソマルトース)の値と比較すると、k_0値が低下した。その減少の度合から第二次アイソトープ効果が確認され、カルボニウム中間体を経由して水解反応が進行すると判断された。 2.糸状菌結晶α-グルコシダーゼのS-S架橋および遊離システイン残基の位置推定…本酵素は7残基のシステインを有するが、このうち遊離型は1残基で、残りは3組のジスルフィド結合を形成することが認められた。蛍光標識試薬を用いて遊離システインを修飾し、位置決定を行った(P2サブユニットのCys-75)。プロテアーゼ消化(非還元条件下)で得られたペプチド断片の蛍光標識試薬を用いた解析で、3組のS-S架橋の位置(P1サブユニットのCys-38とCys-64、P2サブユニットのCys-232とCys-246およびCys-425とCys-436)も決定した。 3.他の糖質関連酵素の一次構造決定…糖質関連酵素として一次構造の解析を進めてきたトラマメα-アミラーゼ、Arthrobacter globiformisイソマルトデキストラナーゼ、ブタ腎臓ムタロターゼについてそれら全容がほぼ明らかになった。
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Research Products
(8 results)
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[Publications] T.Takayanagi: "A New Method of Preparation of Isomaltose from Acid-treated Dextran by Isomalto-dextranase" J.Appl.Glycosci.42. 381-385 (1995)
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[Publications] H.Mori: "Substrate Specificity and Subsite Aflinities of α-Amylase from Germinating Cotyledons of Phaseolus vulgaris L.ev Toramame" J.Appl.Glycosci.42. 387-394 (1995)
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[Publications] 千葉誠哉: "α-グルコシダーゼとグルコアミラーゼ" 日本農芸化学会誌. 69. 1050-1054 (1995)
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[Publications] T.Takayanagi: "Identification of Ionizable Groups Essenitial to the Activity of Isomalto-dextranase from Arthrobacter globiformis" Bosci.Biotech.Biochem.58. 1995-1999 (1994)
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[Publications] H.Kawgishi: "A Sialic Acid-binding Lectin from the Mushroom Hericium erinaceum" FEBS Lett.340. 56-58 (1994)
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[Publications] A.Iwai: "Molecular Cloning and Expression of an Isomalto-dextranase Gene from Arthrobactor globiformis" J.Bacteriol.176. 7730-7734 (1994)
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[Publications] S.Onodera: "Substrate Specificity and Subsite Affinities of Rabbit Lirer Acid α-Glucosidase" J.Biochem.116. 7-11 (1994)
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[Publications] 千葉誠哉: "新しい酵素研究法" 東京化学同人, 201 (1995)