新しい標的遺伝子組み換え技術、遺伝子導入技術の開発とその応用

1994 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 06558114
• Research Category: Grant-in-Aid for Developmental Scientific Research (B)
• Research Institution: National Center of Neurology and Psychiatry
• Principal Investigator: 鍋島 陽一 国立精神・神経センター, 神経研究所遺伝子工学研究部, 部長 (60108024)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 藤沢 淳子 国立精神神経センター, 神経研究所・遺伝子工学, 室長 (60209038) ; 花奥 和則 北里大学, 理学部, 教授 (40189577)
• Keywords: 標的遺伝子組み換 / loxP / Creリコンビネース

Research Abstract

1)クロモゾームの同一の位置に遺伝子を導入する技術の開発
特定の位置にリコンビネースの認識配列を一個だけもつES細胞を多数分離した。このES細胞にリコンビネースの認識配列と解析対象遺伝子を連結したプラスミドとリコビンネースを発現するプラスミドをトランスフェクトし、目的の遺伝子を同じ位置に導入する方法を開発した。loxP配列が導入された場所により、発現が影響されることから、今後は本方法により導入した遺伝子の発現を解析し、より適した細胞を選択する。
2)コンディショナルに遺伝子をノックアウトする技術の開発
オリゴヌクレオチドを合成することにより、loxP配列、Neo-TKカセットの両端にloxP配列をもつプラスミドを作成した。リコンビネースのN端に核移行シグナルを連結し、ユビキタスに発現するプロモーターの下流につないだ発現ベクターを作成した。リコンビネースの認識配列を3個もつターゲッテイングベクターを作り、ES細胞に導入し、相同組み替え細胞を作成した。リコンビネース発現プラスミドをES細胞にトランスフェクトし、導入したNeo-TKカセットのみがぬきとられた細胞とloxPに挟まれた配列全体が抜き取られた細胞を選択した。ついでこの2つの細胞をマウス受精卵へインジェクションした。マウス個体の作成については現在進行中である。組織特異的にあるいは誘導的にリコンビネースを発現させるために筋肉特異的に発現するプロモーターの下流、神経細胞特異的に発現するプロモーターの下流にリコンビネースのcDNAをつないだプラスミドを作り、トランスジェニックマウスを作成している。

Research Products

• [Publications] Ryohei Sibute etal: "The J-Crystallen Enhcirai-Binding Protain 8EFI is a represser of E2-Box-mertitid gale activation" Mol.Cell. Biol.14. 5692-5700 (1994)
• [Publications] Makoto Kunio etal: "Salt-sensitive hypertention in transyenic mice-overexprossig Net-Pretion Exchomzar" Circulation Research. 76. 148-153 (1995)
• [Publications] Katagiri T.etal: "Boru merphozonetie-protein-2 converts the differentiation pathway of C_2Cl_2 myopleats into the esteobloret beneage" J.Cell Biol.127. 1755-1766 (1994)
• [Publications] 鍋島 陽一: "筋発生の分子機構" 蛋白質,核酸,酵素. 40. 101-113 (1995)