新しい標的遺伝子組み換え技術,遺伝子導入技術の開発とその応用

1995 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 06558114
• Research Institution: National Center of Neurology and Psychiatry
• Principal Investigator: 鍋島 陽一 国立精神・神経センター, 神経研究所・遺伝子工学, 部長 (60108024)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 藤沢 淳子 国立精神, 神経センター・神経研究所, 室長 (60209038) ; 花岡 和則 北里大学, 理学部, 教授 (40189577)
• Keywords: 発生工学 / 相同組み換 / 遺伝子ノックアウト / Creリコンビネース / lox P

Research Abstract

固体レベルで遺伝子機能を操作する新しい方法を開発することを目的として実験を行い、以下の結果を得た。
1)特定の位置にリコンビネースの認識配列を一個だけもつES細胞を多数分離した。このES細胞にリコンビネースの認識配列と解析対象遺伝子を連結したプラスミドとリコンビネースを発現するプラスミドをトランスフェクトし、目的の遺伝子を同じ位置に導入する方法を開発したが、効率を改善する必要がある。とりあえず、この細胞を用いてマウス個体を作成中である。
2)標的遺伝子の目的配列を挟んでリコンビネースの認識配列であるloxPを2個もつターゲッテイングベクターを作り、相同組み替え細胞を作成した。この細胞にリコンビネース発現プラスミドをトランスフェクトし、TK遺伝子の欠失をマーカーとして細胞を選択したところ、大部分の細胞でloxPにかこまれた遺伝子が切り取られていることが確認された。現在、個体レベルでの検討を行っている。
3)loxP配列を3個もつ相同組み換えベクターを構築し、相同組み換えES細胞をえた。この細胞にリコンビネースを発現させ、3種類の組み合わせでloxPに囲まれた配列が切り取られた細胞を分離することを試みたが、細胞を分離することができなかった。原因は特定できなかったがGANCを選択に利用することが問題と考え、GANCによる選択をせずに無作為に細胞クローンを選択肢、PCRによって解析することにより、目的の細胞を得ることに成功した。

Research Products

• [Publications] Yoshida S.: "Lysophosphatidic acid and bFGF control different modes in proliferating myoblasts." J. Cell Biol.132. 181-193 (1996)
• [Publications] Yagami-Hiromasa T.: "A metalloprotease-disintogrin porticipating in myoblast fusion" Nature. 377. 652-656 (1995)
• [Publications] Hirata J.: "Asymmetrie segregation of the homeodomain protein Pruspero during Drosoplila development." Nature. 377. 627-630 (1995)
• [Publications] Hoshino M.: "Hikari Genki protein is secreted into synaptic clefts from an early stage of synapse formation in Drosophila" Development. (印刷中).
• [Publications] Kuro-o M.: "Overexpression of sodium-proton exchanger oauses saltsensitive blond preesure elevation in transgenic mice" Circulation Res.76. 148-153 (1995)