1994 Fiscal Year Annual Research Report
Project/Area Number |
06770247
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Research Institution | Kurume University |
Principal Investigator |
久保 慶祐 久留米大学, 医学部, 助手 (50205118)
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Keywords | T細胞 / 活性化抗原 / 遺伝子クローニング |
Research Abstract |
既に決定したH105抗原のN末端の20個のペプチド配列から、このペプチドの両端に対応するDNA配列のmixtureのプライマーを作製し、この抗原を強く発現しているHPB-ALL細胞株のcDNAを合成してRT-PCR法により60塩基を増幅した。この60塩基をTAクローニング法でTベクターにクローニングして、塩基配列を決定した。cDNAライブラリーは当初、HPB-ALL細胞株のmRNAから作製を試みていたが、qualityの高いライブラリーを得ることができず、この抗原を発現しているPHA刺激Tリンパ球のlamda gt10 cDNAライブラリーをclonetech社より購入した。1次スクリーニングとして、このライブラリーのうち計80万個のクローンを大腸菌にトランスフェクションして20枚のシャーレにまき、プラークハイブリダイゼイション法によるスクリーニングを開始した。プローブとして上述の60塩基のうち特異性の高い38塩基の部分をオリゴヌクレオチドとして合成し、p32で末端ラベルして使用した。トランスフェクションしたシャーレにニトロセルロースフィルターをあてレプリカを作製し、このプローブとハイブリダイズさせ、オートラディオグラフィーを行なった。1次スクリーニングで陽性のシグナルがでたプラーク20個を回収し、再び大腸菌にトランスフェクションしてシャーレにまいて2次スクリーニングを行なった。現在、2次スクリーニングで得られた数個のポジティブクローンをプラスミドベクターにサブクローニングし、その塩基配列を解析中である。
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