2006 Fiscal Year Annual Research Report
網羅的RNAiライブラリーを用いたマスト細胞の脱顆粒メカニズムの解明
Project/Area Number |
06J11245
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Research Institution | The University of Tokyo |
Principal Investigator |
菅生 厚太郎 東京大学, 大学院医学系研究科, 特別研究員(DC1)
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Keywords | RNAi / RNAiライブラリー / 遺伝子発現抑制 / 順遺伝学 / マスト細胞 / 脱顆粒 / アレルギー |
Research Abstract |
1.本研究の基盤技術であるEPRIL法の改良及び調整を行った。具体的には従来のEPRIL法で各酵素反応ステップ毎に必要だったポリアクリルアミドゲル電気泳動による精製を、ビオチン・ストレプトアビジンビーズシステムで代用した。また伸張反応に必要だったプライマーを、ニッキングエンザイムであるN.BstNBIより生成される断片で代用した。さらに2段階に分けて行う大腸菌へのプラスミド導入を1段階に短縮することができた。これにより、酵素反応ステップ数が大幅に削減されたため従来のEPRIL法よりも短期間に行えるだけでなく、少量の原料から大規模かつ高品質なRNAiライブラリーが構築可能となり、時間的・経済的コストを大幅に削減することに成功した。この改良型EPRIL法によって、cDNAライブラリー由来のRNAiライブラリーの構築を行った。 2.siRNAの哺乳類細胞への導入において、EPRIL法で採用していたレトロウィルスベクターに加え、レンチウィルスによる導入を検討し、これによっても効率よくRNAiを誘導できることを確認した。これによって、今後必要に応じこれらのウィルスベクターを使い分け、フレキシブルに実験が行えるようになった。 3.平成18年度に予定していたライブラリーセレクションにおいて中心的な実験となるセルソーターの操作技術を修得した。また、基礎的実験を通して条件検討を綿密に行った上で、ライブラリーセレクションを開始させた。
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