1997 Fiscal Year Annual Research Report
神経細胞分化成熟因子としての一酸化窒素の作用;超微量技術による解析
Project/Area Number |
07458206
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Research Institution | YOKOHAMA CITY UNIVERSITY |
Principal Investigator |
加藤 尚彦 横浜市立大学, 医学部, 教授 (80010023)
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Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
中山 孝 横浜市立大学, 医学部, 講師 (90150060)
井上 順雄 横浜市立大学, 医学部, 助教授 (50159985)
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Keywords | 一酸化窒素 / 一酸化窒素生成酵素(N0S) / NOS-isoforms / NOS-isoform mRNAs / Micro-RT-PCR / 脳領野 / 小脳外顆粒層 / 小脳 organotypic culture |
Research Abstract |
既に開発したmicro-RT-PCRを改良し,NOS-isoform mRNAの1コピーを測定可能とした.先ず通常の1/4の6.3mg/250μlのoligo-dT cellulose懸濁液をmicro-spin columnに加え,その底に2×5mmのpelletを形成した.guanidium thiocyanateとN-lauroyl sarcosine溶液50μlで凍結乾燥組織切片または一次培養神経細胞から抽出した1コピーのmRNAを加えたpelletを,よくvortexしてpoly A mRNAをcelluose粒子に結合させ,続いて十分に洗浄した.50μlの1ng poly[dA]30merを含む10mM Tris-HCl,pH7.5-1 mM EDTA溶液を加えてよくvortexした後,65℃で5分加熱してから15,000rpmで10秒室温で遠心し,更に50μlの同じ溶液でcellulose粒子を洗った洗浄液を加えて,25μgのglycogentとmRNAを共沈させ,その沈殿に50μlのRT-PCR反応液を加え29-32cyclesの増幅を行った.この範囲のcyclesで1コピーが測定出来る事は,100ngのラット脳total RNAを10μlのRT反応液に加え倍々希釈し,40μlのPCR反応液を加えて反応させ,希釈系列の或倍数でagarose gelのbandが消える直前の希釈倍数の,bandを十分測定出来る最小cycles数を用いて昭栄した.この1コピーのPCRの確立と並行して,PCRの増幅率を計算する理論式を工夫した(詳細省略).この方法を用いて,ラット小脳以外の脳部位に発現されるnNOS,eNOS及びiNOS mRNAを,各部位の凍結乾燥切片資料を調製して測定した.nNOS mRNAが,海馬の外側核や基底核,扁桃核,嗅球,視床下部の傍室核等に多く見い出され,海馬にはeNOSが見い出された.iNOSはこれらの部位には見い出されなかった.生後5日の小脳切片organotypic cultureの層凍結乾燥試料は,層構造が乱れているため,mRNA測定に十分な試料が得られなかった.NO donors(SIN-1,nitrosocyctein)は1-2mMの濃度では,organotypic culture構造形成を阻害したが,μM濃度では殆ど影響を及ぼさず,予想していた層形成促進効果も見られなかった.同様にnNOS抗体やantisense DNAの効果も明らかでなかった.従って切片培養の技術を確立したが,予期した結果が得られず,この部分の研究は残念な結果に終わった.
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Research Products
(7 results)
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[Publications] Wang W,Nakayama T,Inoue N,Ishii M,Kato T: "Quantitative analysis of nitric oxide synthase expressed in developing and diffettrentiating rat cerebellum." Developmental Brain Rsearch. (in press). (1998)
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[Publications] Furuya S,Nagata R,Ozaki Y,Furuya K,Nakayama T,Nagahama M: "A monocolnal antibody to astrocytes,subepithelial fobloblasts of small intestial villi and interstitial cells of the myentric plexus layer" Anatomical Embryology. 195. 113-126 (1997)
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[Publications] Kato T,Momoki T,Nakayama T,Inoue N,Sato S,Sekihara H: "Expression of glucose transporter isoforms,GLUT1 and GLUT3,in developing rat cerebellum" Journal of Neurochemistry. 69. S25 (1997)
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[Publications] Kato T,Inoue N,Nakayama T: "Expression of nitric oxide synthase in developing and differentiating rat cerebellum." Neurochemical Research. 22. 850 (1997)
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[Publications] Inoue N,Soga T,Nakayama T,Kato T: "Expression of nitric oxide synthase during development of culatured rat cerebellar granule cells." Neurochemical Research. 22. 890 (1997)
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[Publications] 井上順雄,曽我智子,原諭吉,中山孝,加藤尚彦: "遺伝子導入細胞を用いた神経細胞型Naポンプ活性調節機構の解析" 神経化学. 36. 285 (1997)
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[Publications] 井上 順雄: "陽イオンポンプ:脳における情報伝達;神経機能素子と素過程(蛋白質核酸酵素増刊)" 共立出版, 235-243 (1997)