1995 Fiscal Year Annual Research Report
Project/Area Number |
07557179
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Research Category |
Grant-in-Aid for Developmental Scientific Research (B)
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Research Institution | Tokai University |
Principal Investigator |
猪子 英俊 東海大学, 医学部, 教授 (10101932)
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Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
瓜生 登 ニチレイ研究所, 遺伝子ラボ, 研究員
安藤 麻子 東海大学, 医学部, 講師 (40101935)
辻 公美 東海大学, 医学部, 教授 (30055834)
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Keywords | PCR-RFLP / HLA / DNAタイピング / 自動化 / 蛍光標識プライマー / 制限酵素 / GENESCAN / ジェノタイパ- |
Research Abstract |
本研究では、まずHLAホモ接合体細胞DNAを用いて蛍光標識プライマーにてPCRを行い、DQA1遺伝子の第2エキソン242bpを増幅した。増幅後はDQA1遺伝子の切断に用いる5種の制限酵素を加えて反応させ、自動シーケンサーにて電気泳動を行い、GENESCAN 672にて解析したところ、切断されたか否かをバンドの位置で明確に知ることができた。次に同一レーンに同時に3色の蛍光プライマーでのサンプルを注入して泳動を行ったところ、識別は可能であったが、蛍光強度の違いで両面上に濃淡差が現れ、バンドが重なった部分や50bp程度の短いフラグメント部分が確認しにくかった。これはGENESCANの定量性によるもので、各サンプルのPCR産物の濃度ををあらかじめ揃えておく必要性があることを示している。PCRでの増幅には、当初アミノリンク2を結合させた蛍光標識プライマーを用いていたが、結合の過程に差が生じた結果、強度にばらつきが起こることが判明したため、標識試薬に安定性の高い蛍光アミダイドを用いて同様の検討を行ったところ、強度が一定で良好な結果が得られた。サンプルやソフトの取り扱い操作等は簡便であることから、研究計画は順調に進行しているが、今後の課題としては、泳動から解析に要する時間を能率よくこなす配慮であろう。本システムは、一度に108検体の処理が可能な効率的方法であるが、詳細な検討を要する点も残されている。例えば、泳動に使用するゲルを小型に改良することにより、泳動時間が従来の半分の3時間に短縮することが可能となった。さらに解析ソフトとして、新たにジェノタイパ-を加えることで、解析時間の短縮が期待できると考えている。また、これまでの解析から明らかにされた日本人のHLAタイプの頻度は、かなりの偏りが認められることから、研究計画より制限酵素の選択は比較的少数でそのほとんどをカバーできると考えられた。
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Research Products
(8 results)
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[Publications] Naruse K T, et al.: "Cloned PLT cells recognize the fourth, fifth and sixth hypervariable regions at amio acid positions 65-87 of DPB1 molecule." Human Immunology. 42. 123-130 (1995)
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[Publications] Ishihara M, et al.: "Clinical features of sarcolidosis in relation to HLA distribution and HLA-DRB3 genotyping by PCR-RFLP." British Journal of Opthalmology. 79. 322-325 (1995)
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[Publications] Geng L, et al.: "Determination of HLA class II alleles by genotyping in a Manchu population in the northen part of China and its relationship with Han and Japanese population." Tissue Antigens. 46. 111-116 (1995)
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[Publications] Horiki T, et al.: "Combinations of HLA-DPB1 and HLA-DQB1 alleles determine susceptibility to early-onset myasthenia gravis in Japan." Autoimmunity. 19. 49-54 (1995)
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[Publications] 成瀬妙子、猪子英俊: "HLAのDNAタイピング:表記法と臨床応用." 臨床免疫. 27. 242-248 (1995)
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[Publications] 兼重俊彦他: "最新PCR-RFLP情報:1995年版Nomenclature for factors of the HLA systemを対象としたPCR-RFLP法によるDRB1, DPB1タイピング." MHC. 2. 76-84 (1995)
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[Publications] 成瀬妙子、猪子英俊: "日本臨床 広範囲血液免疫学的検査 第4版 下巻 HLA DNAタイピング." 日本臨床社, 676-683 (1995)
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[Publications] Naruse TK, et al.: "The PCR-RFLP method for HLA class II genotyping. Advances in HLA typing, Proceedings of the 11th Japan HLA Workshop (eds Sonoda S, Yashiki S, Fujinobu T) (MHC & IRS supplement to Volume 1)," 日本医学館, 65-72 (1995)