ラジオアイソトープを用いない血中1,25-ジヒドロキシビタミンD濃度測定法の開発

1997 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 07557321
• Research Institution: The University of Tokushima
• Principal Investigator: 武田 英二 徳島大学, 医学部, 教授 (00144973)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 竹谷 豊 徳島大学, 医学部, 助手 (30263825) ; 宮本 賢一 徳島大学, 医学部, 助教授 (70174208)
• Keywords: 活性型ビタミンD / ビタミンD受容体 / エンザイムレセプターアッセイ

Research Abstract

骨粗鬆症の診断および予防のための血中1,25-ジヒドロキシビタミンD(1,25(OH)2D)濃度の測定は重要である。しかし、現在の方法はニワトリやウシ由来のビタミンD受容体(VDR)を使用しており、1,25(OH)2D以外のビタミンD代謝物の影響やラジオアイソトープを用いることから測定施設が限られる。そこで本研究によって、より簡便で安価な1,25(OH)2D濃度を測定するために、ビオチン・アビジン法を応用したエンザイムレセプターアッセイ法の検討を行った。まず、血中1,25(OH)2D濃度の高感度測定法を確立するために、リガンド結合活性が安定して見られるglutathione-S-transferaseとの融合タンパクとしてVDRを大腸菌にて大量に発現させる系を確立した。また、そのVDRを精製し、ラジオアイソトープを用いてリガンド結合能を検討したところ、ウシ胸腺を用いたアッセイ法とほぼ同等の検出感度を得た。また、問題となる1,25(OH)2D以外のビタミンD代謝物の影響については、25(OH)Dがわずかであるが、ウシ胸腺を用いたときよりも良好な結果が得られた。以上のことから、本法により得られたVDRは、血中1,25(OH)2D測定に有用であると考えられた。次に、エンザイムレセプターアッセイにおいてリガンド認識能を向上させるために必要な抗ヒトVDRこうたいを作成した。その結果、抗体価の高い1種類の抗体を得ることが出来た。しかし、本抗体は、ウエスタンブロット法ではVDRを認識することが出来るが、リガンド結合に対する阻害効果を検討したところ、10分の1の希釈で添加した場合にリガンド結合が有為に阻害された。このことから、エンザイムレセプターアッセイ系への応用は困難と考えられた。そこで、さらに種々の抗体を作成した。しかし、リガンド結合を阻害しない抗体は得られなかった。今後は新たな抗体とビオチン化1,25(OH)2Dの合成が必要である。

Research Products

• [Publications] Hidekazu Arai: "A vitamin D receptor polymorphism in the translation initiation codon : effect on protein activity and relation to bonemineral density in Japanese women." J Bone Miner Res. 12. 915-921 (1997)
• [Publications] Ken-ichi Miyamoto: "Structural organization of the human vitamin D receptor chromosomal gene and its promotor." Mol Endocrinol. 11. 1165-1179 (1997)
• [Publications] Yutaka Taketani: "Regulation of type II renal Na+-dependent Pi transporter by 1,25(OH)2D3 : Identification of a vitamin D-responsive element in the human NaPi-3 gene." J Biol Chem. (in press).
• [Publications] Eiji Takeda: "Vitamin D-dependent rickets type I and II." Acta Pediatr Jpn. 39. 508-513 (1997)