単一ニューロン中の神経伝達物質受容体サブユニットmRNAの測定法の開発

1995 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 07558109
• Research Category: Grant-in-Aid for Developmental Scientific Research (B)
• Research Institution: Gunma University
• Principal Investigator: 小澤 瀞司 群馬大学, 医学部, 教授 (40049044)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 都筑 馨介 群馬大学, 医学部, 講師 (60222139)
• Keywords: 受容体サブユニット / 逆転写 / 遺伝子増幅 / 内部標準 / GluR2 / オートラジオグラフィー / パッチピペット / 単一ニューロンRT-OCR

Research Abstract

本研究の目的は、単一ニューロンの細胞質を回収し、そのニューロンに含まれる特定の神経伝達物質受容体サブユニットmRNAの量を定量的に測定する方法を開発することにある。具体的には、回収された細胞質に内部標準物質となる既知の濃度のRNAを加え、この混合物に逆転写遺伝子増幅(RT-PCR)を行い、増幅されたmRNA由来のPCR産物と内部標準物質由来のPCR産物の比を高感度イメージングプレートを用いて計測し、細胞質に含まれるmRNAの絶対量を決定しようとするものである。本年度は以下の2点について実験を進行させた。
1)内部標準物質GluR2XhoIの作成と高感度オートラジオグラフィーの条件設定
Heinemannより譲り受けたGluR2flipプラスミドの1820番目の塩基のシトシンをグアニンに変換させたFluR2XhoIをEcksteinの方法により作成した。作成されたプラスミドは制限酵素XhoIによる切断部位をもち、内在性のGluR2と区別できるので内部標準物質とすることができる。またオートラジオグラフィー装置の条件設定のためにGluR2XhoIのシークエンシングをBAS2000(富士フィルム社製)を用いて行った。^<32>Pで標識された反応物を電気泳動し高感度イメージングプレートに露光して解析した。僅か15分間の露光でシャープなシークエンスラダーが 観察され、X線フィルムを用いた場合の100倍近く高感度であった。また^<32>P量を変化させるとほぼ直線的にdpiが変化するので、露光時間を調節することにより、^<32>Pの相対量をほぼ正しく求めることが可能である。
2)単一ニューロンからの細胞質の回収効率の改善
ラット海馬切片および培養単一ニューロンからからmRNAを含む細胞質を回収するのに、パッチピペットの先端径を太くすることにより、単一ニューロンRT-PCR法の成功率を向上させた。

Research Products

• [Publications] Isa, T. et al.: "Spermine mediates inward rectification of Ca^<2+>-permeable AMPA receptor channels." NeuroReport. 6. 2045-2048 (1995)
• [Publications] Isa, T. et al.: "Distribution of neurones expressing inwardly rectifying and Ca^<2+>-permiable AMPA receptors in rat hippocampal slices." Journal of Physiology. 491.3. 719-733 (1996)
• [Publications] Ozawa, S. et al.: "Molecular basis for functional defferences of AMPA-subtype glutamate receptors." News in Physiological Sciences. (in press). (1996)