細菌アルギン酸リアーゼのX線結晶構造解析と反応機構

1995 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 07660111
• Research Category: Grant-in-Aid for General Scientific Research (C)
• Research Institution: Kyoto University
• Principal Investigator: 村田 幸作 京都大学, 食糧科学研究所, 教授 (90142299)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 三上 文三 京都大学, 食糧科学研究所, 助教授 (40135611)
• Keywords: 難治性細菌感染症 / アルギン酸 / アルギン酸リアーゼ / X線結晶構造解析

Research Abstract

細菌由来のアルギン酸リアーゼを細菌感染症の治療薬として利用するために、本酵素の3次元構造決定のためのX線結晶構造解析、並びに、酵素のフラグメント化と活性中心決定のためのタンパク質工学的研究を並行して進めた。
3次元構造の解析は現在重原子置換に手間取っており、予備的X線データの段階にあるが、結晶構造に関する基本的データは収集した。なぜ、重原子が結晶に入らないのか不明であるが、最近、水銀に可能性を見出したので、現在一気に進めたい。
酵素のフラグメント化は順調に進んでおり、この低分子化酵素をポリエチレングリコールで修飾することによって、無抗原性酵素の調製に成功した。現在、in vivo有効性確認の実験に入っている。
また、活性中心に関しては化学修飾及び多のリアーゼ殿ホモロジー検索により、ライシンとヒスチヂンが活性発現に関与したアミノ酸であることまで突き止めた。
一方、アルギン酸リアーゼ生産菌であるSphingomonas sp.によるアルギン酸分解の機構に関する検討で、本細胞表面に巨大な穴の存在を見出した。そして、この穴(ビット)がアルギン酸の細胞内部への取り込みに関与していることを示唆する結果を得た。このビット野存在は、微生物では初めての発見であり、高分子物質の膜透過に関して新たな知見を加えた。また、アルギン酸を生産する病原性菌Pseudomonas aeruginosaのアルギン酸合成制御に関して検討した結果、アルギン酸合成が菌形と関係しているとを突き止めた.即ち、球形菌はアルギン酸を合成せず、桿形菌のみが顕著にアルギン酸を合成した。従って、この病原性菌の形態を球形に維持する薬剤は、細菌感染症の治療薬となり得る可能性があることを示した。

Research Products

• [Publications] 村田幸作: "アルギン酸分解の新しい分子機構" バイオサイエンスとインダストリー. 53. 36-38 (1995)
• [Publications] Mikami Bunzo: "Crystalization and Preliminary X-Ray Diffraction Studies of Bacterial Alginate Lyase" Journal of Fermentation and Bioengineering. 77. 691-692 (1994)
• [Publications] 村田幸作: "細菌によるアルギン酸分解の分子機構とバイオフイルム" Bulletin of the Research Institute for Food Science, Kyoto University. 58. 32-33 (1995)
• [Publications] Tomohiro Hisano: "Pit Structure on Bacterial Cell Surface" Biochemical and Biophysical Research Communications. (in press). (1996)