2007 Fiscal Year Annual Research Report
大腸菌mRNAエンドリボヌクレアーゼの活性調節機構
Project/Area Number |
07F07732
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Research Institution | Osaka University |
Principal Investigator |
米崎 哲朗 Osaka University, 大学院・理学研究科, 教授
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Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
SEBASTIEN Lemire 大阪大学, 大学院・理学研究科, 外国人特別研究員
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Keywords | RNase LS / エンドリボヌクレアーゼ / rnlA / rnlB / dmd / 大腸菌 / T4ファージ |
Research Abstract |
RNase LSの中心役割を担うRnlAとRNase LSの阻害活性をもつT4ファージのDmdの相互作用を調べるためのツールとしてT4Δdmd変異体を作成した。これを用いてT4ファージファミリー間で異なるアミノ酸配列をもつDmdの活性を調べている。との計画のために数百種類存在しているT4ファミリーを利用し始めた。 構造生物学的解析を実施するために、RnlAの量産を行ったところ、様々な方法を用いても可溶化できなかった。そこで、RnlAと強く結合することが明らかとなっているTpiAとHisタグ化RnlAを共発現させる系を構築した。この場合、RnlAの単独発現に比べ不溶化しにくいことがわかったので、現在はスケールアップを目指している。 rnlA遺伝子と共にRNase LS活性に必須であるrnlBはこれまでプラスミドを用いた遺伝学的解析が困難であった。今回、その理由が明らかとなってきた。例え低コピーであってもプラスミドから発現したRnlAやRnlBはゲノム遺伝子の変異を相補するどころか、むしろ正常なRNase LS活性に対して負の干渉作用をもつことが判明した。恐らく、プラスミドから過剰生産されたRnlAやRnlBは、これらと相互作用する少量の必須タンパクを競合する結果、活性をもった完全なRNase LS複合体の量が返って減少してしまうと考えられる。そこで、red-swap法を導入して、ゲノム上のrnlAとrnlB遺伝子を欠失させた変異体に、発現操作可能なプロモーターに制御されるrnlAとrnlB遺伝子をゲノムに持ち込んで解析する系を立ち上げた。
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Research Products
(1 results)