2008 Fiscal Year Annual Research Report
小型霊長類コモンマーモセットES細胞を用いた効率的血小板分化誘導法の開発
Project/Area Number |
07J00162
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Research Institution | Kyushu University |
Principal Investigator |
井上 朋子 (横尾 朋子) Kyushu University, 生体防御医学研究所, 特別研究員(DC1)
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Keywords | コモンマーモセット / ES細胞 / 血小板 / 分化誘導 / 遺伝子導入 / cDNAライブラリー / レンチルスベクター / ヒト胎児肝cDNA |
Research Abstract |
コモンマーモセット(以下CM)ES細胞由来血小板の高効率産生を目標として(A)In vitroにおけるCM ES-tall/scl細胞株由来CD41陽性細胞からの効率的な巨核球成熟化の条件検討と電子顕微鏡解析、ならびに(B)新規造血関連分子の探索を行った。 (A)CM ES-tall/scl細胞株由来CD41陽性細胞からの巨核球成熟化の効率的条件を検討した。具体的には培養開始14日目に同CD41陽性細胞をMACSにて選別後、CM gata1,CM nf-e2,CM runxlcをレンチウィルスシステムを用いて感染・導入し、分化培養実験を行った。培養液には成熟化因子(ビタミンB_<12>・葉酸、トロンボポエチン、SU6656等)を添加した。遺伝子導入後、7-14日後にCD41抗体染色、核染色を行ったが、どの遺伝子を導入した場合においても顕著な成熟化(多核化)は観察できなかった。また分化培養液の上清から血小板分画を分離し(前年度に分離法を開発)、CM血小板に最適化した、固定、血小板活性化を行い、電子顕微鏡を用いた検討を行った。ポジティブコントロールとして用いたCM末梢血血小板に比べ、CM ES細胞由来血小板分画の細胞では、形態学的な判別が困難であり、vWF抗体を用いた免疫電顕でも明らかなvWF陽旨の細胞は検出できなかった。 (B)上記の結果を踏まえ、新規造血関連分子の探索を行った。具体的には、まず胎児期の造血器官である胎児肝臓を用いてヒト胎児肝cDNA発現ライブラリーを構築した。次に同cDNAライブラリーからレンチウィルスライブラリーを作製した。さらに数種類のサイトカイン依存性白血病細胞株へ、同ウィルスライブラリーを感染させサイトカイン非依存性獲得を指標としてスクリーニングを行い、新規造血分子の探索実験を行った。その結果、新規造血関連分子として複数の候補遺伝子を同定することに成功した。候補遺伝子の中には、既知の報告では造血と直接の関与がない遺伝子も含まれており、大変意義深い探索結果であった。現在これらの遺伝子について細胞株レベルで機能等を解析中である。
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Research Products
(3 results)